肺真菌病的精準(zhǔn)診治

思思120 2023-06-06 發(fā)布于廣西

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作者：劉雅欣

單位：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

一、肺真菌病的診治難點(diǎn)

提到肺真菌病，我們或許首先會(huì)想到從“侵襲性肺部真菌感染（IPFI）”到“侵襲性肺真菌病（invasion pulmonary mycosis，IPM）”概念的切換。2006年《中華內(nèi)科雜志》發(fā)表的《侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則（草案）》中對(duì)IPFI的定義是不包括真菌寄生和過(guò)敏所致的支氣管肺部真菌感染[1]，這一概念更多描述的是病原菌與宿主的一種共存狀態(tài)。2007年《中華結(jié)核和呼吸雜志》發(fā)表的《肺真菌病診斷和治療專家共識(shí)》提出了“侵襲性肺真菌病”的概念，是指真菌直接侵犯（非寄生、過(guò)敏或中毒）肺或支氣管引起的急、慢性組織結(jié)構(gòu)病理?yè)p害所導(dǎo)致的疾病[2]，“侵襲性肺真菌病”這一概念更能反映疾病的病理實(shí)質(zhì)，體現(xiàn)了對(duì)疾病本質(zhì)更深的認(rèn)識(shí)。

我國(guó)一項(xiàng)納入1998～2007年臨床確診肺真菌病患者的多中心回顧調(diào)查入選了10個(gè)城市16個(gè)中心的所有滿足診斷標(biāo)準(zhǔn)的474例肺真菌病患者，收集臨床、微生物學(xué)及影像學(xué)資料并進(jìn)行回顧性分析。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在肺真菌病中，占比最高的是肺曲霉病和肺念珠菌病，兩者之和約占70%[3]。這一數(shù)據(jù)與臨床工作中對(duì)肺真菌病的實(shí)際診治情況符合。

肺真菌病有一定的危險(xiǎn)因素，包括：高齡、外周血中性粒細(xì)胞缺乏、應(yīng)用廣譜抗生素或類固醇激素3周以上、器官移植及接受免疫抑制劑治療、既往侵襲性感染或定植病史、燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷、合并惡性腫瘤、糖尿病等基礎(chǔ)疾病、營(yíng)養(yǎng)不良、胃酸抑制[4]，這些危險(xiǎn)因素也是臨床診斷肺真菌病的首要線索。

肺真菌病的常見(jiàn)癥狀包括：①持續(xù)發(fā)熱＞96 h，經(jīng)積極的抗生素治療無(wú)效；②咳嗽、咳黏稠或呈黏液膠質(zhì)樣、咯血、胸痛、喘息、呼吸困難；③念珠菌血癥時(shí)可出現(xiàn)肝、脾多發(fā)性小膿腫、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、肝功能異常、不明原因的神志障礙以及低血壓、休克等。臨床上無(wú)異常表現(xiàn)。體征方面，口咽部可見(jiàn)鵝口瘡或散在白膜，肺部可聞及干/濕啰音，口唇發(fā)紺，胸膜摩擦音。肺真菌病常見(jiàn)的影像學(xué)表現(xiàn)為：①兩肺散在斑片狀影；②肺段或肺葉的實(shí)變；③多發(fā)結(jié)節(jié)狀高密度影；④早期出現(xiàn)胸膜下密度增高的結(jié)節(jié)實(shí)變影；⑤暈輪征、空腔、新月體征；⑥新出現(xiàn)的肺部非特異性局部浸潤(rùn)影。其中，⑤和⑥往往是肺曲霉病比較有特異性的影像學(xué)表現(xiàn)。上述臨床特征缺乏特異性，因此不能完全依據(jù)這些進(jìn)行肺真菌病的診斷。

2008年指南提出了肺真菌病的分級(jí)診斷，即極似診斷、臨床診斷、確定診斷三個(gè)診斷級(jí)別，分別依照危險(xiǎn)因素、臨床特征、微生物學(xué)檢查和組織病理學(xué)檢查結(jié)果而定。

組織病理學(xué)是肺真菌病確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”。判斷患者是否為侵襲性肺真菌病，可以通過(guò)菌種的位置、排列、數(shù)目、寬度、分隔、分枝、染色、孢子等特征進(jìn)行鑒別[5]，尤其是念珠菌、曲霉和毛霉，并且提倡廣泛開(kāi)展經(jīng)皮肺穿刺活檢或經(jīng)支氣管鏡黏膜活檢和肺活檢，直接取得肺組織標(biāo)本做病理學(xué)檢查和特殊染色以明確病原體[4]。

組織中念珠菌、曲霉和毛霉的鑒別

然而，在臨床中，活檢操作往往會(huì)遇到不少的阻礙，例如患者高齡、基礎(chǔ)狀態(tài)差、難以接受有創(chuàng)操作、過(guò)度擔(dān)憂、患者及家屬不能獲得知情同意等，這也阻礙了臨床對(duì)肺真菌病的確定診斷。因此，調(diào)查顯示肺真菌病的確定診斷率較低，也與此有關(guān)。

二、侵襲性真菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法臨床應(yīng)用專家共識(shí)

侵襲性真菌病的診斷引起臨床多學(xué)科關(guān)注，早期明確診斷是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。為了促進(jìn)臨床醫(yī)師深入了解并合理應(yīng)用侵襲性真菌病的診斷方法，提高侵襲性真菌病的診斷水平，中國(guó)醫(yī)藥教育協(xié)會(huì)真菌病專業(yè)委員會(huì)聯(lián)合多學(xué)科專家提出《侵襲性真菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法臨床應(yīng)用專家共識(shí)》[6]。共識(shí)針對(duì)侵襲性真菌病微生物學(xué)檢查和組織病理學(xué)檢查的臨床應(yīng)用，主要提出以下建議。

1. 微生物檢查的臨床應(yīng)用

（1）真菌直接鏡檢：懷疑真菌感染患者的BALF標(biāo)本及無(wú)菌體液（除血液外），應(yīng)行真菌直接鏡檢，同時(shí)進(jìn)行真菌培養(yǎng)及血清學(xué)檢查。非無(wú)菌部位標(biāo)本（痰、尿、糞等），如行真菌培養(yǎng)，需要在培養(yǎng)的同時(shí)行真菌直接鏡檢。真菌直接鏡檢敏感性不高，多次送檢能提高檢出率?；顧z組織標(biāo)本在進(jìn)行組織病理和真菌培養(yǎng)檢查的同時(shí)，應(yīng)進(jìn)行直接壓片，熒光染色后進(jìn)行真菌直接顯微鏡檢查。

（2）真菌培養(yǎng)和鑒定：在送檢真菌培養(yǎng)檢查同時(shí)，應(yīng)盡可能同時(shí)送檢真菌直接鏡檢。組織標(biāo)本進(jìn)行組織病理檢查時(shí)，同時(shí)應(yīng)進(jìn)行真菌培養(yǎng)檢查。真菌培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)于細(xì)菌培養(yǎng)，一般需要7 d，特殊情況需要2~4周以上，如果懷疑雙相真菌感染（馬爾尼菲籃狀菌、組織胞漿菌等），應(yīng)同時(shí)在28℃和37℃兩個(gè)溫度下培養(yǎng)。非無(wú)菌部位真菌培養(yǎng)陽(yáng)性，存在污染菌或定植菌可能，需要對(duì)培養(yǎng)所獲真菌進(jìn)行判斷，是否有臨床意義（即致病真菌），需要結(jié)合真菌直接鏡檢、組織病理檢查、患者臨床表現(xiàn)以及真菌致病性等進(jìn)行綜合判斷。真菌鑒定一般需要鑒定至種或復(fù)合群（complex）水平。根據(jù)菌種類型，參考相應(yīng)真菌感染診療指南選擇抗真菌藥物治療。少見(jiàn)真菌或從疑難重癥患者分離到的致病真菌應(yīng)做體外藥敏試驗(yàn)，作為臨床用藥參考。

（3）血清學(xué)檢查：樣本類型多為血清，部分檢查可用于腦脊液、BALF或其他體液。常用方法為：曲霉半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)（GM試驗(yàn)）和真菌1,3?β?D葡聚糖檢測(cè)（G試驗(yàn)）、隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)（CrAg）。GM試驗(yàn)適用于懷疑侵襲性曲霉病的患者，可以檢測(cè)血清或BALF。陽(yáng)性結(jié)果是侵襲性曲霉病臨床診斷證據(jù)之一。還需要結(jié)合臨床表現(xiàn)、其他真菌學(xué)檢查以及影像學(xué)表現(xiàn)綜合判斷。G試驗(yàn)用于懷疑侵襲性真菌病（包括念珠菌病、曲霉病、肺孢子菌病等，不包括隱球菌病、毛霉?。┑幕颊撸潢幮越Y(jié)果排除真菌感染的意義更大。隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)用于診斷隱球菌病，腦脊液或血清抗原陽(yáng)性是隱球菌病的確診證據(jù)?？贵w檢測(cè)適用于無(wú)明顯免疫抑制人群。慢性空洞性肺曲霉病可檢測(cè)曲霉IgG抗體，變應(yīng)性支氣管肺曲霉病患者可檢測(cè)曲霉特異性IgE抗體。

（4）分子生物學(xué)檢查：國(guó)外有念珠菌T2磁共振（T2MR）結(jié)合PCR技術(shù)檢測(cè)念珠菌血癥的設(shè)備。熒光定量PCR方法在多種深部感染真菌（曲霉、肺孢子菌、念珠菌）檢測(cè)中有應(yīng)用前景。二代測(cè)序不作為常規(guī)檢測(cè)推薦，疑難病例可開(kāi)展對(duì)無(wú)菌組織、無(wú)菌體液或BALF的二代測(cè)序。

2. 組織學(xué)檢查的臨床應(yīng)用

本共識(shí)對(duì)侵襲性真菌病診斷方法的應(yīng)用人群、送檢要求、結(jié)果解讀及臨床意義進(jìn)行了介紹并提出建議，強(qiáng)調(diào)對(duì)于侵襲性真菌病高?；颊撸瑧?yīng)綜合應(yīng)用多種診斷方法、正確取材送檢、提高結(jié)果解讀能力、了解不同方法的臨床意義，以便合理應(yīng)用，更好地服務(wù)于患者。

免疫抑制人群懷疑真菌感染時(shí)，應(yīng)盡可能做組織活檢?；顧z組織做病理學(xué)檢查同時(shí)，應(yīng)采集新鮮組織做組織真菌培養(yǎng)。HE染色不易發(fā)現(xiàn)真菌成分，應(yīng)做針對(duì)真菌的特殊染色：六胺銀染色（GMS）或過(guò)碘酸希夫染色（PAS）。免疫抑制人群，不能明確感染種類時(shí)，組織病理的特殊染色需包括針對(duì)真菌的GMS或PAS；針對(duì)分枝桿菌的抗酸染色；針對(duì)細(xì)菌的革蘭染色。懷疑雙相真菌中馬爾尼菲籃狀菌或組織胞漿菌感染時(shí)，骨髓穿刺液可做吉姆薩染色。

三、mNGS在肺真菌病診斷中的應(yīng)用

1. mNGS用于真菌檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì)

近年來(lái)，mNGS在感染性疾病診斷中的應(yīng)用不斷增多，因其具備一定的優(yōu)勢(shì)：①不需要培養(yǎng)，節(jié)省時(shí)間；②相較于傳統(tǒng)方法（G/GM試驗(yàn)）可以精確區(qū)分物種，甚至亞型，特異性高；③在某些類型真菌的檢測(cè)敏感性高于傳統(tǒng)方法，如曲霉；④無(wú)需假設(shè)，可覆蓋罕見(jiàn)真菌和其他類型病原體；⑤可檢測(cè)真菌的耐藥基因。但mNGS也有一定的劣勢(shì)：①對(duì)采樣要求較高，需要有效采集真菌感染的病灶部位；②真菌細(xì)胞壁厚（如曲霉），或有堅(jiān)固莢膜（如隱球菌），破壁困難，核酸不易釋放，可造成假陰性；③在實(shí)驗(yàn)流程中（比如建庫(kù)）容易引入環(huán)境真菌或試劑中真菌核酸（如灰綠曲霉）的污染，造成假陽(yáng)性；④真菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)不全，很多真菌缺乏全基因組數(shù)據(jù)（識(shí)別不出），且在公開(kāi)的數(shù)據(jù)庫(kù)中真菌序列經(jīng)常存在人源序列的污染（識(shí)別錯(cuò)誤）。

所以，mNGS檢測(cè)真菌時(shí)需要注意：最佳檢測(cè)標(biāo)本是BALF；在技術(shù)上改進(jìn)破壁技術(shù)；合理去除人源背景，提高病原體的檢出率；完善真菌基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

2. mNGS的真菌檢測(cè)結(jié)果的解讀

mNGS檢測(cè)結(jié)果回報(bào)后，如何判讀？

（1）對(duì)檢出的病原體分類：①高等級(jí)的致病性真菌：如曲霉、肺孢子菌、馬爾尼菲籃狀菌、新生隱球菌，在大部分樣本中都可能是病原體。②中等級(jí)的條件致病菌：如念珠菌屬，在外周血、腦脊液、穿刺液等無(wú)菌體液樣本中可能是病原體。③低等級(jí)的條件致病菌：如念珠菌，痰液、BALF、尿液等大部分樣本中可能是共生菌，只在少數(shù)情況下如侵入操作后的腦脊液/外周血樣本、感染性心內(nèi)膜炎的贅生物中可能致病。④疑似背景微生物引起的感染：在某些感染樣本中能與低等級(jí)的條件致病菌相互轉(zhuǎn)化，需要結(jié)合患者傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查結(jié)果及臨床特征進(jìn)行判斷。

（2）結(jié)合臨床判讀結(jié)果：①陽(yáng)性結(jié)果的判讀：a. 若mNGS結(jié)果陽(yáng)性且符合臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢查，推薦根據(jù)mNGS結(jié)果指導(dǎo)臨床決策。b. 若mNGS結(jié)果陽(yáng)性且符合臨床表現(xiàn)，但缺乏其他實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，應(yīng)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并完善傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查加以驗(yàn)證。c. 若mNGS結(jié)果陽(yáng)性，但臨床表現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室檢查結(jié)果不支持，應(yīng)以傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果為首要臨床參考依據(jù)。②在陰性結(jié)果的判讀中：真陰性，排除感染；假陰性，根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果高度提示感染可能，建議再次重復(fù)mNGS檢測(cè)。

3. mNGS在真菌感染診斷中的價(jià)值

目前，分子生物學(xué)（PCR、mNGS）已經(jīng)在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用，其中PCR在曲霉和念珠菌感染病理標(biāo)本中有確診價(jià)值。對(duì)于真菌感染的分子生物學(xué)檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)外只認(rèn)可PCR；不論曲霉還是念珠菌，如果組織標(biāo)本的PCR陽(yáng)性均屬于確診依據(jù)；而血清、BALF的PCR檢測(cè)陽(yáng)性只能作為曲霉的臨床診斷依據(jù)。

mNGS在我國(guó)剛剛普及，正在累積經(jīng)驗(yàn)，可以作為輔助診斷的指標(biāo)，尚不能作為病原學(xué)的確診依據(jù)。mNGS為臨床提供了一種具有很高敏感性和特異性的病原微生物檢測(cè)方法，具有劃時(shí)代意義。此外，mNGS不應(yīng)該用于普通感染患者，而應(yīng)在疑難、危重、特殊感染患者中使用，目前不倡導(dǎo)將其用于療效隨訪和耐藥性檢測(cè)。臨床中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注mNGS報(bào)告的正確解讀，要做到小心謹(jǐn)慎，結(jié)合臨床，綜合評(píng)估。

四、總結(jié)

肺真菌病缺乏特異的臨床特征，組織病理結(jié)果是金標(biāo)準(zhǔn)，但也使得確定診斷困難。《侵襲性真菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法臨床應(yīng)用專家共識(shí)》針對(duì)侵襲性真菌病微生物學(xué)檢查和組織病理學(xué)檢查的臨床應(yīng)用，對(duì)侵襲性真菌病診斷方法的應(yīng)用人群、送檢要求、結(jié)果解讀及臨床意義進(jìn)行了介紹并提出建議，強(qiáng)調(diào)對(duì)于侵襲性真菌病高?；颊撸瑧?yīng)綜合應(yīng)用多種診斷方法、正確取材送檢、提高結(jié)果解讀能力、了解不同方法的臨床意義，以便合理應(yīng)用，更好地服務(wù)于患者。新的檢驗(yàn)手段如mNGS的出現(xiàn)有助于臨床肺真菌病的精準(zhǔn)診斷，但主要推薦用于疑難危重、特殊感染的患者。無(wú)論何種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，都需要結(jié)合臨床評(píng)估才有意義。

參考文獻(xiàn)

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[5] 廖萬(wàn)清，吳紹熙. 現(xiàn)代真菌病學(xué)[M]. 上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2017：227.

[6] 中國(guó)醫(yī)藥教育協(xié)會(huì)真菌病專業(yè)委員會(huì), 國(guó)家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（北京大學(xué)第一醫(yī)院）, 國(guó)家血液疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（北京大學(xué)人民醫(yī)院）. 侵襲性真菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法臨床應(yīng)用專家共識(shí)[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2022, 61(2):134-141.

作者簡(jiǎn)介

劉雅欣

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士
黑龍江省醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)委員
中國(guó)肺癌防治聯(lián)盟黑龍江省分聯(lián)盟委員
中國(guó)肺癌防治聯(lián)盟哈醫(yī)大二院結(jié)節(jié)診治分中心委員
黑龍江省醫(yī)療保健國(guó)際交流促進(jìn)會(huì)呼吸與危重癥分會(huì)委員
作為副主編譯作1部，參與多項(xiàng)課題研究
對(duì)呼吸內(nèi)科常見(jiàn)疾病有扎實(shí)的理論知識(shí)基礎(chǔ)以及較豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，熟練掌握呼吸內(nèi)科各種臨床操作技能

*本文根據(jù)“呼吸危重癥菁英秀”第四十六期專題視頻整理，感謝劉雅欣醫(yī)師予以審核。

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