所用數(shù)據(jù)為一個屬內(nèi)不同種不同群體的葉綠體基因組序列，數(shù)量為80條。

發(fā)現(xiàn)用全長序列建樹的時候，不適合選用太多外類群，否則ML法中會導(dǎo)致屬內(nèi)分枝的枝長特別短。原因應(yīng)該是基因間隔區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域序列位點的差異較大。

枝長含義

NJ：表示遺傳距離；
MP：性狀狀態(tài)變換的替換數(shù)；
ML/BI：該分枝上的相對進(jìn)化數(shù)量（遺傳變異量）；每個位點上的替換數(shù)（一般以每位點多少次核苷酸替換或氨基酸取代來表示）。

遺傳距離

大多數(shù)情況以序列來說遺傳距離就是兩個OTU（個體、群體、物種或基因家族）之間序列的差異值。

序列比對

多序列比對用mafft得到的結(jié)果較為準(zhǔn)確，muscle比對的速度較快。

多序列比對的絕大多數(shù)算法都是基于漸進(jìn)比對的概念。簡單來說就是先從兩個序列的比對開始，逐漸添加新序列，直到所有的序列都加入為止。但是不同的添加順序會產(chǎn)生不同的比對結(jié)果。所以由最相似的兩個序列開始比對，由近到遠(yuǎn)逐步完成最為可靠。

mafft --thread 15 --auto 80-AcoeOut.fasta > 80-AcoeOut_aln.fasta
##比對時如果不清楚什么參數(shù)合適，加個參數(shù) --auto，軟件可以自動幫你處理

挑選保守位點進(jìn)行下一步建樹

序列比對完后，用于建樹的序列位點必須保證具有良好的同源性。所以需要刪除序列分歧很大的區(qū)域和gap區(qū)域。
我用的軟件為Gblocks，主要目的是把有g(shù)ap的位點全部去除，參數(shù)為-b5=n，其余的選項有-b5=h，h表示half 指去除在大于50%的序列中出現(xiàn)gap的位點。

Gblocks 80-AcoeOut_aln.fasta -t=d -b5=n

最大簡約法（軟件PAUP）

最大簡約法的樹長指所有性狀在一棵樹上的進(jìn)化改變總數(shù)。

計算得到的結(jié)果可能會有許多樹長相等的簡約樹，此時需要計算它們的一致樹。分為strict consensus和semistrict consensus等，strict表示100%，在所有簡約樹中都出現(xiàn)的分枝，才會出現(xiàn)在一致樹中，否則為梳子。這個閾值可以調(diào)。

一般文章中所用的系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)都為ML或BI樹，所以要把MP的bootstrap值標(biāo)到ML/BI法的底樹上。

1.cstatus  ##查看數(shù)據(jù)特征，如簡約信息位點數(shù)量等
2.tstatus
3.define outgroup
4.analysis-branch and bound  ##數(shù)據(jù)量大用heuristic search
5.describetrees
6.contree ##計算一致樹
7.bootstrap  ##自舉值
8.print bootstrap consensus

進(jìn)化模型

DNA序列進(jìn)化就是序列位點上的核苷酸隨時間的變化，主要包括堿基替換、缺失和插入。

兩條比對好的DNA序列的同源位點之間很容易看出堿基的相同或不同，但是在漫長的進(jìn)化過程中實際發(fā)生了什么我們并不知道。最常見的當(dāng)然是單次替換，但是當(dāng)進(jìn)化時間較長時，已經(jīng)發(fā)生過替換的某些位點可能會再次發(fā)生替換，即多重替換。

DNA序列的進(jìn)化模型將DNA的進(jìn)化作為一系列隨機(jī)突變來描述，并明確定義了4種堿基之間相互的替換速率。
DNA進(jìn)化模型的參數(shù)主要有4類：

1. 堿基組成頻率
2. 替換速率矩陣：指定了4種堿基之間在單位時間內(nèi)或給定分枝長度下相互替換的概率。
3. 不變位點比例
4. 位點之間速率的變異：不同位點之間替換速率的差異。

ML法和BI法都需要選擇合適的進(jìn)化模型。模型選擇軟件具有的模型越多，檢測結(jié)果越準(zhǔn)確，但建樹軟件不一定支持該模型。
判斷模型與數(shù)據(jù)擬合好壞的標(biāo)準(zhǔn)主要有AIC和BIC等。

最大似然法（軟件IQ-TREE）

似然值是當(dāng)模型（樹和進(jìn)化參數(shù)）為真時能夠得到實際觀測數(shù)據(jù)的概率。似然值是觀測數(shù)據(jù)（即序列）的條件概率，其條件為計算似然值時依據(jù)的模型，而不是模型為真時的概率。

ML法建樹的過程是先選擇一個適合數(shù)據(jù)集的進(jìn)化模型，然后對指定拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的一棵樹優(yōu)化分枝長度，以使得該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的似然值最大化。通過計算不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)樹的似然值，將具有最大似然值的樹看成是指定模型下的能夠產(chǎn)生觀測數(shù)據(jù)的最佳估計。

ML法采用的搜索方法主要是啟發(fā)式搜索，步驟如下：

1. 通過NJ樹或逐步添加序列的方法構(gòu)建初始樹；
2. 以初始樹為基礎(chǔ)通過各種分枝交換方法（TBR、SPR等）計算似然值，將最大似然值的樹保存，并作為下一輪重排的初始樹；
3. 重復(fù)進(jìn)行分枝交換，直到不能增加似然值為止。重排的最后獲得的最大似然值樹即為ML樹。

建ML樹的軟件用RAxML的較多，但近來IQ-TREE的引用量一路上升。綜合使用下來，個人感覺IQ-TREE的速度真快。
使用過程是下載了PhyloSuite的組件，從選模型到構(gòu)樹一站式操作還挺方便的。注意下載好后首先要配置用于不同分析的插件。

貝葉斯推論法（軟件MrBayes）

BI法與ML法不同的是，前者根據(jù)提供的數(shù)據(jù)和選擇的替代模型尋找可能性最大的樹，而ML法則是尋找合適的樹以使得數(shù)據(jù)的可能性最大。

推斷系統(tǒng)發(fā)育樹的步驟為：

1. 選擇一些樹作為起始點；
2. 判定這些樹的似然值；
3. 修改樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和分支長度；
4. 計算出新樹的似然值；
5. 新樹的似然值比舊樹大，則接受新樹。

如此就構(gòu)成了一代，一次又一次的重復(fù)迭代，直到新樹的似然值不再有明顯變化，即樹的似然值不再有顯著區(qū)別，參數(shù)已收斂為止。如果沒有收斂，適當(dāng)?shù)脑黾哟鷺淅^續(xù)跑。

如何判斷參數(shù)是否已收斂

軟件運行完畢后，看結(jié)果文件的分離頻率平均標(biāo)準(zhǔn)差值（Average standard deviation of split frequencies）

該值<0.01時，說明兩次運行的結(jié)果差異很少，參數(shù)已收斂；
該值>0.05時，需要繼續(xù)運行。

同樣是在PhyloSuite中運行

##只輸出偶數(shù)行
sed -n '2~2p' test.txt
##只輸出奇數(shù)行
sed -n '1~2p' test.txt

## 刪除空行
sed '/^$/d' test.txt
## 計算行數(shù)
sed -n '$=' test.txt