MEGA 是一個關(guān)于序列分析以及比較統(tǒng)計的工具包，其中包括有距離建樹法和 MP 建樹法；可自動或手動進行序列比對，推斷進化樹，估算分子進化率，進行進化假設(shè)測驗，還能聯(lián)機的 Web 數(shù)據(jù)庫檢索。下載后可直接使用，主要包括幾個方面的功能軟件：i)DNA 和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)的分析軟件。ii)序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成距離數(shù)據(jù)后，對距離數(shù)據(jù)分析的軟件。 iii)對基因頻率和連續(xù)的元素分析的軟件。iv)把序列的每個堿基/氨基酸獨立看待（堿基/氨基酸只有 0 和 1 的狀態(tài)）時，對序列進行分析的軟件。v)繪制和修改進化樹的軟件，進行網(wǎng)上 blast 搜索。 用 MEGA 構(gòu)建進化樹有以下步驟：

1. 16S rDNA 測序和參考序列選取 從環(huán)境中分離到單克隆，去重復(fù)后擴增 16S rDNA 序列并測序，然后與數(shù)據(jù)庫 http://www.ncbi.nlm./blast/Blast.cgi 比對，找到相似度最高的幾個序列，確定一下你分 離的細菌大約屬于哪個科哪個屬，如果相似度達到百分之百那基本可以確定你分離得到的就 是 Blast 到的那個，然后找一到兩個同科的，再找一到兩個同目的，再找一到兩個同綱的細 菌，把序列全部下下來，以 FSATA 形式整合在 TXT 文檔中，如：

   

   參考序列選擇有幾個原則：a，不選非培養(yǎng)(unclutured)微生物為參比；b，所選參考序列要正確，里面無錯誤堿基；c，在保證同屬的前提下，優(yōu)先選擇 16S rDNA 全長測序或全基因組測序的種；d，每個種屬選擇一個參考序列，如果自己的序列中同一屬的較多，可適當選擇 兩個參考序列。

   2. 序列比對 將整理好的序列導(dǎo)入 clustalx1.83，如圖

   

   接著：

   程序自動運行，得出結(jié)果，自動輸出 .aln 和 .dnd 為后綴的兩個文件。 序列比對也可以直接用 MEGA 來做。

   打開程序 MEGA，如下圖所示：

   MEGA3.1 只能打開 meg 格式的文件，但是它可以把其他格式的多序列比對文件轉(zhuǎn)換過來， 用.aln 格式（Clustal 的輸出文件）轉(zhuǎn)換.meg 文件。點 File:Convert to MEGA Format，打開轉(zhuǎn) 換文件對話框，從目的文件夾中選中 Clustal 對比分析后所產(chǎn)生的.aln 文件，點擊打開。

   轉(zhuǎn)換好的 meg 文件，會彈出一個提示信息，點擊 ok。

   查看 meg 序列文件最后是否正常，若存在 clustal. *行，即可刪除。點存盤保存 meg 文件，meg 文件會和 aln 文件保存在同一個目錄。

   關(guān)閉轉(zhuǎn)換窗口，回到主窗口，現(xiàn)在點面板上的“Click me to activate a data file”打開剛才的 meg 文件。

   如果為蛋白質(zhì)序列，選擇“protein sequence”，電擊“OK”，得到以下圖示，數(shù)據(jù)輸入之后 的樣子，窗口下面有序列文件名和類型。

而在另外一個窗口內(nèi)，出現(xiàn)以下數(shù)據(jù)文件點擊選擇和編輯數(shù)據(jù)分類圖標， 可對所選擇 的序列進行編輯，完成后點擊 close 即可。

序列編輯完成后，可進行保存，點擊保存后出現(xiàn)以下界面，點擊 ok 即可。

構(gòu)建進化樹的算法主要分為兩類：獨立元素法（discrete character methods）和距離依靠法 （distance methods）。所謂獨立元素法是指進化樹的拓撲形狀是由序列上的每個堿基/氨基酸 的狀態(tài)決定的（例如：一個序列上可能包含很多的酶切位點，而每個酶切位點的存在與否是 由幾個堿基的狀態(tài)決定的，也就是說一個序列堿基的狀態(tài)決定著它的酶切位點狀態(tài)，當多個 序列進行進化樹分析時，進化樹的拓撲形狀也就由這些堿基的狀態(tài)決定了）。而距離依靠法 是指進化樹的拓撲形狀由兩兩序列的進化距離決定的。進化樹枝條的長度代表著進化距離。 獨立元素法包括最大簡約性法（Maximum Parsimony methods）和最大可能性法（Maximum Likelihood methods ）； 距 離 依 靠 法 包 括 除 權(quán) 配 對 法 （ UPGMAM ） 和 鄰 位 相 連 法（Neighbor-joining）。

phylogeny→UPGMA

用 Bootstrap 構(gòu)建進化樹，MEGA 的主要功能就是做 Bootstrap 驗證的進化樹分析，Bootstrap 驗證是對進化樹進行統(tǒng)計驗證的一種方法，可以作為進化樹可靠性的一個度量。 各種算法雖然不同，但是操作方法基本一致。進化樹的構(gòu)建是一個統(tǒng)計學(xué)問題。我們所構(gòu)建 出來的進化樹只是對真實的進化關(guān)系的評估或者模擬。如果我們采用了一個適當?shù)姆椒?，?么所構(gòu)建的進化樹就會接近真實的“進化樹”。模擬的進化樹需要一種數(shù)學(xué)方法來對其進行評 估。不同的算法有不同的適用目標。一般來說，最大簡約性法適用于符合以下條件的多序列： i 所要比較的序列的堿基差別小，ii 對于序列上的每一個堿基有近似相等的變異率，iii 沒有過多的顛換/轉(zhuǎn)換的傾向，iv 所檢驗的序列的堿基數(shù)目較多（大于幾千個堿基）；用最大可能性法分析序列則不需以上的諸多條件，但是此種方法計算極其耗時。如果分析的序列較多，有可能要花上幾天的時間才能計算完畢。

參數(shù)的設(shè)置：phylogeny→bootstrap test of phylogeny→NJ

②系統(tǒng)進化樹的測試方法，可以選擇用 Bootstrap，也可以選擇不進行測試。重復(fù) 次數(shù)(Replications)通常設(shè)定至少要大于 100 比較好，隨機數(shù)種子可以自己隨意設(shè)定，不會影 響計算結(jié)果。一般選擇 500 或 1000。有許多 Model 供選擇，默認為 Kimura 2-parameter， 不同的 Model 有不同的算法，具體請參考專業(yè)的生物信息學(xué)書籍。設(shè)定完成，點 compute， 開始計算。

結(jié)果輸出：這個過程所耗時間和序列的數(shù)量和長短成正比，程序就會產(chǎn)生這么一個樹，該窗口中有兩個屬性頁，一個是原始樹，一個是 bootstrap 驗證過的一致樹。樹枝上的數(shù)字表示 bootstrap 驗證中該樹枝可信度的百分比。 結(jié)果如下：

8. 進化樹的優(yōu)化： １）利用該軟件可得到不同樹型，如下圖所示：

除此之外，還可以有多種樹型，根據(jù)需要來選擇。 ２）顯示建樹的相關(guān)信息：點擊圖標 i。

３）點擊優(yōu)化圖標，可進行各項優(yōu)化： Tree 欄中，可以進行樹型選擇：rectangular tree/circle tree/radiation tree。每種樹都可以進行長度，寬度或角度等的設(shè)定。