產(chǎn)生背景及簡介

隨著不同物種基因組測序的快速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的DNA 序列信息，這時(shí)就需要一種簡便而快速的統(tǒng)計(jì)分析工具來對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的分析，以提取其中包含的大量信息。MEGA 就是基于這種需求開發(fā)的。MEGA 軟件的目的就是提供一個(gè)以進(jìn)化的角度從DNA 和蛋白序列中提取有用的信息的工具，并且，此軟件可以免費(fèi)下載使用。

現(xiàn)在我們使用的是 MEGA4 的版本。它主要集中于進(jìn)化分析獲得的綜合的序列信息。使用它我們可以編輯序列數(shù)據(jù)、序列比對、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、推測物種間的進(jìn)化距離等。此軟件的輸出結(jié)果資源管理器允許用戶瀏覽、編輯、打印輸入所得到的結(jié)果而且所得到的結(jié)果具有不同形式的可視化效果。此外，該軟件還能夠得出不同序列間的距離矩陣，這是他不同與其他分析軟件的地方。在計(jì)算矩陣方面有一些自己的特點(diǎn)：

1. 推測序列或者物種間的進(jìn)化距離
2. 根據(jù)MCL(Maximum Composite Likeliood method)的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹
3. 考慮到了不同堿基替換的不同的比率，考慮到了堿基轉(zhuǎn)換和顛換的差別。
4. 隨時(shí)可以使用標(biāo)注：所以的結(jié)果輸入都可以使用標(biāo)注，而且標(biāo)注的內(nèi)容可以被保存，復(fù)制。

具體使用

我們以分析 20 個(gè)物種的血紅蛋白為例來具體說明此軟件的具體使用情況。

啟動程序

1. 運(yùn)行環(huán)境：在Windows 95/98, NT, ME, 2000, XP, vista 等操作系統(tǒng)下均可使用。
2. 下載安裝：可以直接登陸 www.megasoftware.net 進(jìn)行下載安裝，另外還可以從http://abc.cbi.pku.edu.cn/tools/phylogeny.php 中的鏈接進(jìn)去。
3. 雙擊桌面快捷方式圖標(biāo)， 進(jìn)入主界面；或者從開始菜單，單擊圖標(biāo)啟動。

序列分析

1.啟動

單擊后，會出現(xiàn)如下界面：

這里有三個(gè)選項(xiàng)，分別對應(yīng)三種不同的情況：以下分別予以介紹：

Create a new alignment ：是在你沒有任何比對的時(shí)候使用，比如你只有一個(gè)fasta 格式的序列就可以選擇這個(gè)選項(xiàng)。
Open a saved alignment session：使用它可以打開一個(gè)我們已經(jīng)比對好的序列文件；
Retieve a sequence from a file ：這種情況同第一種情況相似，只是不用選擇是DNA 還是蛋白質(zhì)序列比對，選擇的也是fasta 格式的文件，打開后的界面都是一樣的。

以第一種情況為例說明，點(diǎn)擊如出現(xiàn)下界面：

這里我們分析的是蛋白序列所以選擇 No。然后從 data 菜單選擇輸入數(shù)據(jù)文件如圖：

選擇你保存的 fasta 格式序列后就會出現(xiàn)：

菜單的使用

Data菜單

Creat a new ：創(chuàng)建一個(gè)新的數(shù)據(jù)比對文件，也就是說當(dāng)我們比對完一組后，想接著比對另一組，那么使用它就可以不用退出直接把數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入；
Open：打開先前已經(jīng)比對并保存好的文件，它包含兩個(gè)子菜單：retive sequence from file 和saved aligment session ；
Close: 關(guān)閉當(dāng)前的比對數(shù)據(jù)文件；Save session：保存當(dāng)前比對結(jié)果，可以給比對的結(jié)果一個(gè)文件名；
Export alignment：將當(dāng)前的序列比對結(jié)果輸出到指定文件，有兩種輸入格式可供選擇：MGTA 和FASTA.
DNA sequence：使用它來選擇輸入的數(shù)據(jù)DNA 序列，這里需要說明的是如果你輸入的數(shù)據(jù)是氨基酸序列的話，比對窗口只顯示一個(gè)標(biāo)簽，若是DNA 序列的話則顯示兩個(gè)標(biāo)簽，一個(gè)是DNA 序列的，另一個(gè)是氨基酸序列的。如下圖：

Protein sequences：選擇輸入的氨基酸序列，選擇后，所以的位點(diǎn)就被當(dāng)作氨基酸殘基位點(diǎn)來對待。
Translate/untranslate：只有比對的序列是編碼蛋白的DNA序列的時(shí)候才可用。它可以根據(jù)指定的遺傳密碼表將DNA 序列翻譯成特定的氨基酸序列。
Select genetic code table：使用它將編碼蛋白的DNA 翻譯成特定的蛋白序列。
Reverse complement：將選擇的一整行的DNA 序列變?yōu)榕c之互補(bǔ)配對堿基序列。
Exit alignment explorer：退出序列比對的資源管理窗口。

Edit 菜單

使用這個(gè)菜單可以對我們的比對序列進(jìn)行想要的一些編輯工作具體為
Undo：撤銷上一步操作；
Copy：復(fù)制；cut：剪切；Paste：粘貼；前面三個(gè)操作都可以只針對一個(gè)堿
基或氨基酸殘基也可以是一段甚至是整個(gè)序列；
Delete：從比對表格中刪除一段序列；
Delete gaps：去掉序列中的空缺；
Insert blank sequence：重新插入一空行；標(biāo)簽和序列都是空的；
Insert sequence from file：從已保存的文件中插入新的序列；

Select sites：選擇一列序列，與點(diǎn)擊比對表上方的灰白空格作用類似；
Select sequence：選擇一行序列，與點(diǎn)擊比對表格左側(cè)的標(biāo)簽名作用類似；
Select all：全選；
Allow base editing：只讀保護(hù)，只有選擇后才能對序列進(jìn)行編輯操作，否則所以的序列為只讀格式，不能進(jìn)行任何編輯操作。

Search 菜單

用來快捷查找序列中的標(biāo)記未定或者目的堿基或殘基。
Find motif：選擇后出現(xiàn)如下對話框：

輸入你想要查看的一小段序列。找到后會以黃色標(biāo)出；
Find next：在序列的下游查找目的序列片段；
Find preious：在序列的上有查找目的序列片段；
Find marked sites：查找標(biāo)記位點(diǎn)；
Highlight motif：突出標(biāo)記已經(jīng)選擇的位點(diǎn)。

Web 菜單

這個(gè)菜單提供一個(gè)鏈接 Genbank 的入口，可以在網(wǎng)上直接做Blast 搜索。當(dāng)手上沒有準(zhǔn)備好要比對的序列時(shí)，可以直接去網(wǎng)上搜索。
Query gene banks：開啟NCBI 的主頁；
Do blast search:開啟NCBI BLAST 主頁；
Show browser：開啟網(wǎng)頁瀏覽器。

Sequencer 菜單

此菜單下只有一個(gè)子菜單：edit sequencer file，用來打開一個(gè)打開文件對話框，此對話框可以打開一個(gè)sequencer data file，一旦打開，這個(gè)文件就在trace data file viewer/editor 的對話框中展示出來。這個(gè)編輯窗口允許你查看和編輯automatd DNA sequencer 產(chǎn)生的trace data。它可以閱讀和編輯ABI 和Staden 格式文件并且序列可以直接被導(dǎo)入到序列比對窗口或被上傳到網(wǎng)頁瀏覽器做blast 搜索。

Display 菜單：

這個(gè)菜單相對簡單，主要用來調(diào)整工具欄。
Toolbars：工具欄菜單，它包含一些子菜單，選擇后就會出現(xiàn)在比對的窗口中；
Use colors：將不同的位點(diǎn)以不同的顏色顯示；
Background color：選擇后位點(diǎn)的顯示與位點(diǎn)一樣的背景顏色；
Font：字體對話框，通過選擇來調(diào)整窗口中的序列字符的大小。

實(shí)例介紹alignment 菜單

Mark/unmark site:在比對的表格中標(biāo)記或者不標(biāo)記一個(gè)單一位點(diǎn)，一次每條序列只能被標(biāo)記一個(gè)位點(diǎn)，不同序列間的位點(diǎn)你可以選擇同一列的，也可以是錯(cuò)開的，要根據(jù)自己的目的進(jìn)行選擇。選擇標(biāo)記后的序列可以使用align marked sites進(jìn)行比對分析。
Align marked sites:比對標(biāo)記的序列，在這里如果在兩個(gè)或多個(gè)序列間標(biāo)記了不在一列的位點(diǎn)重新比對后會出現(xiàn)空格。如圖：

Unmarked all sites：把所以標(biāo)記的位點(diǎn)去標(biāo)記；
Delete gap-only site：去掉序同是空格的一列；這在多序列比對前很有用。

Auto-fill gaps：使用空格補(bǔ)齊不同長度的序列。
Align by ClustalW：此軟件整合了clustalw 程序，這也是它的方便之處，選擇
要比對的序列后點(diǎn)擊會出現(xiàn)下面的對話框：

這是一個(gè)序列比對參數(shù)設(shè)置對話框，需要注意的是：這個(gè)軟件不會考慮到核酸序列中的編碼位點(diǎn)，所以在比對的過程中可能會在編碼區(qū)中插入空格，所以如果分析cDNA 或者編碼序列建議將他們翻譯成蛋白序列后在比對。

一對序列比對和多序列比對下的設(shè)置都是一樣的如下：
Gap opening penalty：空格罰分設(shè)置，增加一個(gè)空格就罰相應(yīng)的分值，增加這一分值會降低空格出現(xiàn)的頻率。
Gap extension penalty：空格擴(kuò)展罰分，就是根據(jù)空格的長度來罰分，增加這一分值會使空格變短，末端空格不計(jì)入罰分。

一般參數(shù)：
DNA/protein weight matrix：選擇不同的加權(quán)矩陣；
Residue-specific penalties：特殊氨基酸罰分。在序列比對的過程中特異氨基酸可能增加或減少罰分值，比如：富含甘氨酸的區(qū)段比富含纈氨酸的區(qū)段更可能有空格出現(xiàn)，因而他們的罰分不同。
Hydrophilic penalties：如果有連續(xù)的5 個(gè)或者更多的親水性氨基酸的話，他們傾向于出現(xiàn)空格，這些區(qū)段很可能出現(xiàn)環(huán)狀或卷曲，因此罰分不一樣。
Gap separation distance：參數(shù)設(shè)置來盡可能降低空格之間離的太近的機(jī)會，小于指定數(shù)值的空格罰分要多余其他的，這不能避免出現(xiàn)相鄰空格，只能降低他們出現(xiàn)的頻率。
Use negative matrix：使用負(fù)性矩陣，
Delay divergent cutoff：若一條序列相似性低于設(shè)定的百分值將推遲比對。

當(dāng)一切參數(shù)都設(shè)定好了之后就點(diǎn)擊 OK 就可以進(jìn)行比對了，中間出現(xiàn)一個(gè)過度對話框。比對結(jié)束后，可以將結(jié)果保存（data/save session/），以供構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹使用。另外，如果不保存直接關(guān)閉，系統(tǒng)跳出一個(gè)確認(rèn)對話框。

下面這個(gè)是序列數(shù)據(jù)管理的管理界面，此外我們還可以通過主界面上的data/open data 路徑打開，效果是一樣的，注意這里打開的只能是剛才保存的后綴是.MEG 的文件。

當(dāng)這個(gè)序列數(shù)據(jù)界面出來后，注意軟件的主界面發(fā)生了一定的變化，多出了幾個(gè)功能菜單：

下面就著重介紹一下序列數(shù)據(jù)窗口的一些具體使用：
這個(gè)窗口用來展示比對后的序列數(shù)據(jù)，這里提供了許多的功能菜單用來查看序列比對后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果或者來選擇想要的子序列。

Data 菜單

Write data to file：導(dǎo)入序列打開窗口；
Translate/untranslate:將蛋白編碼序列翻譯成蛋白序列，或者再轉(zhuǎn)變成核酸序列；
Selected genetic code table：打開select genetic code 對話框，從這個(gè)對話框可以選擇編輯或者添加遺傳密碼表；
Setup/select genes and domains：打開sequence data organizer 對話框，在這個(gè)對話框里可以定義和編輯基因和結(jié)構(gòu)域。

使用這個(gè)窗口可以查看，定義，和選擇結(jié)構(gòu)域和基因，并且標(biāo)記單個(gè)的位點(diǎn)。具體使用這里不作詳細(xì)介紹。
Setup/select taxa and groups:打開一個(gè)可以編輯分類和定義分類組的對話框：

這個(gè)窗口分為兩個(gè)子窗口，左邊的是分類組，顯示不同的分組情況，右邊的是未分組窗口顯示還沒有歸入任何一個(gè)組群的分類。中間和下邊是一些操作鍵，通過他們我們可以建立新的組，如果你將所以的分類都?xì)w入到不同的組里，并且給予組名，你們在序列數(shù)據(jù)窗口中就會在物種名字后邊顯示他所屬的組名。

Display 菜單

Show only selected sequence：只顯示你所選擇的感興趣的序列；
Use identical symbol：將一列中絕大部分相同等堿基或氨基酸字符用點(diǎn)來代替；
Color cells：將序列中連續(xù)的一致的堿基或者氨基酸給以相同的顏色背景以區(qū)別顯示；
Sort sequences：將顯示的分類以不同的方式排序，可以根據(jù)序列名字、組名來排序；
Restore input order：將經(jīng)過修改的序列順序回復(fù)到剛打開時(shí)的樣子；
Show sequence name：顯示序列的名字，不選則隱藏；
Grouped：顯示組名；
Change font：更改顯示的字體格式。
Quite data viewer：退出界面。

Highlight 菜單

這里的子菜單大部分都顯示在工具欄里，如圖所示：

分別是高亮度顯示保守序列、可變序列、比對信息序列、和一列中至少有兩個(gè)不同字符的列等。

Statistics 菜單

Nucleotide composition：當(dāng)序列為核酸時(shí)可用。計(jì)算每條序列中的不同的堿基百分比；
Nucleotide pair frenquencies：只有當(dāng)序列為核酸時(shí)可用。
Codon usage：只有序列為編碼蛋白的核酸序列時(shí)可用。計(jì)算出codon usage的百分比和RSCU（relative synonymous codon usage）值；
Amino acid composition：當(dāng)序列為氨基酸序列或編碼蛋白的核酸序列時(shí)可用。計(jì)算每條序列氨基酸殘基的百分比；并且跳出一個(gè)顯示窗口，在這個(gè)窗口中可以進(jìn)行許多操作：可以得到的這一數(shù)據(jù)保存到文件中；還可以打印出來；還以直接分析統(tǒng)計(jì)所
得到的結(jié)果，查看每一行等。具體大家可以自己摸索；

Use all selected sites：保證上面的分析統(tǒng)計(jì)是在選擇所有的序列下進(jìn)行的，不考慮被標(biāo)記的位點(diǎn)。

從以上大家應(yīng)該可以粗略的了解到這個(gè)軟件的強(qiáng)大而又方便的序列比對分析的功能。下面再簡要介紹主頁面上的幾個(gè)菜單的使用。

Distances 菜單

相關(guān)原理：兩條序列間的進(jìn)化距離是通過計(jì)算兩條序列間堿基或氨基酸替換得來的，推測進(jìn)化距離是研究分子進(jìn)化、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和推測物種分化時(shí)間的基礎(chǔ)，這個(gè)軟件中包括了絕大部分廣泛使用的推測進(jìn)化距離的方法。值得提出的是，該軟件還使用解析公式和bootstrap 的方法來評價(jià)出現(xiàn)的錯(cuò)誤。

該軟件所包括的方法大致可被分為三類：核酸；同義—非同義替換；氨基酸。

1) 核酸：序列是核酸和核酸之間的比較，計(jì)算編碼蛋白和非編碼蛋白的核酸序列間的進(jìn)化距離，主要有兩種方法： No. of differences 和p-distance 還包括許多的模型：Jukes-Cantor Model 、Tajima-Nei Model、Kimura 2-Parameter Model、Tamura 3-Parameter Model、Tamura-Nei Model、Maximum Composite Likelihood Model 等，可以根據(jù)需要進(jìn)行不同的選擇。

2) 同義-非同義替換：序列是編碼子和編碼子之間的比較，所以只能用來計(jì)算編碼蛋白的序列。常用的模型有： Nei-Gojobori Method 、 Modified Nei-Gojobori Method 、Li-Wu-Luo Method 、 Pamilo-Bianchi-Li Method、Kumar Method 等。

3) 氨基酸類：序列間是氨基酸殘基之間的比較。能夠用來計(jì)算氨基酸序列間以及編碼蛋白的核酸間的距離，編碼蛋白的核酸在比對的時(shí)候自動被翻譯成氨基酸序列進(jìn)行比較。常用的模型有：Poisson Model、Equal Input Model、 Dayhoff and JTT Models。

Choose model…：選擇模型，選擇跳出一個(gè)距離模型的選項(xiàng)窗口：

在這個(gè)窗口里，model 選項(xiàng)是選擇推測進(jìn)化距離的隨機(jī)模型的，可以通過單擊綠色小方框進(jìn)行選擇。Pattern among lineages：只有當(dāng)距離模型選定后才可用；
rates among sites：允許位點(diǎn)間存在不同的替換率。選好后單擊OK 即可。
Compute pairwise：單擊出現(xiàn)上面類似的對話框：

Compute：選擇是只計(jì)算進(jìn)化距離還是選擇計(jì)算同時(shí)進(jìn)行評價(jià)。選擇后者會出現(xiàn)standard error computation by 選項(xiàng)，通過這一選項(xiàng)選擇解析公式或者bootstrap method 來評價(jià)結(jié)果的好壞。Gaps and missing data：在計(jì)算開始前選擇去除所有包含比對空格和失意的位點(diǎn)；

另外，最初你也可以保留這些位點(diǎn)，在必要的時(shí)候在去掉。Labled sites：只有當(dāng)一些或者全部位點(diǎn)有相關(guān)標(biāo)簽時(shí)才可用。
點(diǎn)擊綠色方框，就可以看到包括選擇標(biāo)簽的位點(diǎn)，如果你選擇這些位點(diǎn)的話，這些位點(diǎn)就最先從數(shù)據(jù)中提出來。選好后compute 出現(xiàn)以下窗口：

這是一個(gè)比對后的距離矩陣窗口，這個(gè)窗口包括很多不同的功能菜單，來調(diào)節(jié)顯示的內(nèi)容。File 菜單中有一個(gè)子菜單是Show Analysis Description:顯示計(jì)算所用的不同的選項(xiàng)，這些信息可以被保存或者打印出來。

Average Menu：這里面有個(gè)子菜單Overall 單擊會顯示比對的總體平均距離。
Distance 菜單中其他的子菜單操作同上類似只是內(nèi)容略有不同，具體可自行摸索。

Phylogeny菜單

Phylogeny 選項(xiàng)中有以下子菜單：

其中 Construct Phylogeny 和Bootstrap Test of Phylogeny 基本一致，其中后者給出了在計(jì)算過程中的出現(xiàn)的概率。

最大簡約法 Maximum Parsimony，使用的運(yùn)算法則是branch-and bound 的檢索方法。得到的是無根樹。這種方法在序列非常相似以及序列數(shù)目較小的情形下較適用（構(gòu)建21條序列的進(jìn)化樹時(shí)，在幾種方法中花費(fèi)的時(shí)間最長）。

在實(shí)際運(yùn)行得到拓?fù)鋱D之后，上面有兩個(gè)選項(xiàng)，點(diǎn)擊 Original tree，可以選擇查看計(jì)算所得到的所有結(jié)構(gòu)樹。

點(diǎn)擊 Bootstrap consensus tree 得到我們所需要的結(jié)果

鄰接法 Neighbor Joining: 當(dāng)所考慮的譜系間進(jìn)化速率可變時(shí)，鄰接法特別適用。鄰接法能給出枝長最小平方估計(jì)的序列，即能最真實(shí)的反映序列間的真實(shí)距離。鄰接法得到的進(jìn)化樹也是無根樹。鄰接法有6 種計(jì)算方法，分別是No. of Differences、p-distance、Poisson Correction、Equal Input、PAM Matrix (Dayhoff)、JTT Matrix (Jones-Taylor-Thornton)。通常選
擇p-distance。

最小進(jìn)化法 Minimum Evolution：該方法和鄰接法基本相似，在此不作介紹。

算術(shù)平均的非加權(quán)對群法 UPGMA：它假設(shè)沿著進(jìn)化樹分支的變化速率為一個(gè)常數(shù)，而距離近似為非加權(quán)的。UPGMA 法由計(jì)算關(guān)系最近序列間的枝長開始，然后計(jì)算序列對與下一個(gè)序列對間的距離平均值，不斷重復(fù)直到所有序列都被包括在樹中。如果樹枝間的突變率不一致時(shí)，UPGMA 法將導(dǎo)致一個(gè)錯(cuò)誤的樹，因此該法現(xiàn)在已基本不用。

Relative Rate Tests

點(diǎn)擊 Tajima’s Test，得到下面的對話框。

我們可以在對話框中選擇比對序列中的任意三條序列，點(diǎn)擊OK 之后，可以得到這三條序列進(jìn)行比對的一些基本信息。

因此當(dāng)我們得出系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)，如果對其中的一些分支存在疑問，就可以將該分支序列進(jìn)行Tajima 檢測，幫助我們得出正確的結(jié)論。

原文作者：張志想 王升正 周建橋 鐘增明