【原】學(xué)習(xí)LCMS基礎(chǔ)知識(shí)，了解下常說的同位素峰有啥用？

有機(jī)合成公眾號(hào) 2022-04-13

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LCMS是常用的監(jiān)測(cè)手段，下面對(duì)其一些基礎(chǔ)知識(shí)進(jìn)行介紹，內(nèi)容整理自網(wǎng)絡(luò)，版權(quán)歸原作者所有。質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測(cè)量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。

質(zhì)譜分析原理

分子在真空中被電子轟擊，形成離子，通過電磁場(chǎng)按不同m/e分離；質(zhì)譜圖的表示方法：以棒圖形式表示離子的相對(duì)峰度隨m/e的變化；提供的信息：分子離子及碎片離子的質(zhì)量數(shù)及其相對(duì)峰度，提供分子量，元素組成及結(jié)構(gòu)的信息，可以用于測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量、化合物分子式及結(jié)構(gòu)式。質(zhì)譜樣品：適合分析相對(duì)分子質(zhì)量為50~2000的液體、固體有機(jī)化合物樣品，試樣應(yīng)盡可能為純凈的單一組分。

以下是FT-ICR質(zhì)譜儀工作過程：

離子產(chǎn)生

離子收集

離子傳輸

FT-ICR質(zhì)譜的分析器是一個(gè)具有均勻（超導(dǎo)）磁場(chǎng)的空腔，離子在垂直于磁場(chǎng)的圓形軌道上作回旋運(yùn)動(dòng)，回旋頻率僅與磁場(chǎng)強(qiáng)度和離子的質(zhì)荷比有關(guān)，因此可以分離不同質(zhì)荷比的離子，并得到質(zhì)荷比相關(guān)的圖譜。

離子回旋運(yùn)動(dòng)

傅立葉變換

相關(guān)概念

離子豐度（Abundance of ions）：檢測(cè)器檢測(cè)到離子信號(hào)強(qiáng)度。

相對(duì)離子豐度（Relative abundance of ions）：以質(zhì)譜圖中指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)最強(qiáng)峰（基峰）的強(qiáng)度為100%。其它離子峰對(duì)其歸一化所得到的強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖均以離子相對(duì)豐度值為縱坐標(biāo)。離子的豐度與物質(zhì)的含量相關(guān)，因此是質(zhì)譜定量的基礎(chǔ)。

EI：電子轟擊源質(zhì)譜，常用于GC-MS系統(tǒng)。

API：大氣壓電離源質(zhì)譜，常用于LC-MS系統(tǒng)。

MALDI：基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜，常用于生物大分子分析。

HPLC：高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。

UPLC：超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）色譜理論認(rèn)為提高色譜柱的效能（efficiency）就能增加儀器的解析度（resolution），而運(yùn)用粒徑低于2μm的小顆粒無疑是增加效能的好方法。但減小固定相的粒度以增加色譜柱效能一直是色譜儀器科學(xué)的瓶頸，因?yàn)樾☆w粒不僅要求系統(tǒng)能承受高于目前極限壓力（比如6000psi/400bar），需要更小的系統(tǒng)體積（死體積），并且需要能適應(yīng)可能只有幾秒峰寬的高速檢測(cè)器。

ESI：Electron Spray Ionization的縮寫，意思是電噴霧離子源，是質(zhì)譜儀中較為常用的一種離子化方式。電噴霧離子源屬于一種軟電離源,能使大質(zhì)量的有機(jī)分子生成帶多電荷的離子。

APCI：Atmospheric Pressure Chemical Ionization的縮寫，大氣壓化學(xué)電離源 APCI是20世紀(jì)90年代后使用的液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的接口技術(shù)之一。溶液在氣流作用下形成氣溶膠，蒸發(fā)，電暈放電使溶劑電離，電子轉(zhuǎn)移或電子捕獲，使樣品帶電。

Mass Spectrum (MS) 相關(guān)知識(shí)

離子在電場(chǎng)中加速，在磁場(chǎng)中偏轉(zhuǎn)。正離子源適用于堿性化合物: 含氮化合物更容易粘附氫正離子，在正離子源中容易出分子離子峰。負(fù)離子源適合酸性化合物: 酸性化合物更容易轟擊掉氫正離子，如酸，酚類化合物。

一、加減分子量峰

常用的MS或者LCMS檢測(cè)為ESI電離源，當(dāng)一種化合物不出MS或者M(jìn)S異常的還可以作ACPI電離源檢測(cè)，可能會(huì)得到相應(yīng)的結(jié)果。

加分子量峰: M+1(H+); M+23(加Na+); 2M+23(兩分子共用一個(gè)鈉離子)。

減分子量峰: M-56(脫叔丁基)和M-100(脫Boc),非常常見; M-16(脫NH3)和M-17(脫水)以及(M+2)/2(在電場(chǎng)里面粘附上2個(gè)正離子)，含烯丙基或芐基的雜原子化合物，很容易出烯丙基或芐基的正離子碎片峰，比較常見。

常見的離子片段
正模式	原因
M+14	在LCMS中羧酸與甲醇成酯，或其他多一個(gè)碳的情況
M+18	加NH4
M+19	水合
M+23	加鈉離子
M+33	加甲醇
M+39	加鉀離子
M+42	加乙腈
M+64	加乙腈加鈉離子
2M+1	二聚+氫離子，倍峰
2M+23	二聚+鈉離子
一系列相差42的峰	可能為石蠟油污染
一系列相差44的峰	可能為聚乙二醇污染
M-16	脫掉NH3
M-17	脫水
M-44	羧酸和含Cbz的分子常見，重排后脫CO2
M-56	含Boc的分子常見，脫叔丁基
M-100	含Boc的分子常見，脫Boc
(M+2)/2	分子絡(luò)合兩個(gè)氫離子，半峰

負(fù)模式	原因
M-1	[M-H]-
M+X	[M+X]-, X=溶劑或緩沖溶液的陰離子
M+S-1	[M+S-H]-, S=溶劑

詳細(xì)內(nèi)容點(diǎn)擊 ---》有機(jī)合成路線：LCMS常出現(xiàn)的干擾離子峰總結(jié)

二、同位素峰

特別注意精確分子量和摩爾分子量的區(qū)別：質(zhì)譜分子量都是用同位素質(zhì)量計(jì)算得到的。Chemdraw里精確分子量是高分辨的最高強(qiáng)度峰，是用組成該分子的所有原子在天然界中豐度最高的同位素的質(zhì)量加和得到的，對(duì)有多個(gè)同位素的原子，同一個(gè)分子碎片就有可能出現(xiàn)多個(gè)質(zhì)譜峰。比如下圖中的例子：氯原子有原子量為34.97和36.97兩個(gè)同位素, 而且天然豐度都是接近3;1, 其質(zhì)譜圖中就會(huì)出現(xiàn)155.05和157.05兩個(gè)分子離子峰, 且強(qiáng)度比接近3:1。自然界中的元素都是各個(gè)同位素的混合，因此摩爾分子量是按自然界中同位素的比例平均得到的。平時(shí)測(cè)MS時(shí)，可以直接通過 Chemdraw（手機(jī)APP--Kingdraw也挺好用）計(jì)算出質(zhì)譜的分子離子峰。

同位素峰的一個(gè)常見應(yīng)用就是可以直接判斷所測(cè)的化合物是否含有Cl或Br等具有明顯同位素的原子。常見氯和溴同位素的表現(xiàn): 一個(gè)氯峰高比M+2/M=1/3; 一個(gè)溴為峰高比M+2/M=1/1), 同時(shí)含有多個(gè)同位素的表現(xiàn)可以用Chemdraw精確模擬。

另外一些特殊情況下可以通過同位素峰判斷是否反應(yīng)完全，如下圖所示：A經(jīng)過偶聯(lián)生成B，利用LCMS監(jiān)測(cè)反應(yīng)，如不仔細(xì)看同位素峰，就會(huì)可能原料沒有反應(yīng)。正模式下, 原料A[M+H]: 268, 270; 產(chǎn)物B只有[M+H]: 270。

HPLC相關(guān)注意事項(xiàng)

基本原理: 實(shí)驗(yàn)室常過的硅膠柱和TLC都是是正相柱，常見的HPLC是反相柱兩者在出峰時(shí)間上大體相反，即極性大的化合物先出峰，極性小的后出峰。但也不是所有情況都相反，利用有些在TLC板上極性小的化合物卻含有水溶性好的基團(tuán)，出峰位置很可能會(huì)提前。

HPLC的應(yīng)用: 測(cè)定反應(yīng)液中各個(gè)組分含量，測(cè)定化合物純度，監(jiān)控反應(yīng)是否完全。參照出峰時(shí)間和出峰面積來判斷原料轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物生成量。

流動(dòng)相方法: 0-60，5-95，10-80，30-90等等，可以讓分析人員設(shè)置: 。0-60，5-95，10-80，30-90這些數(shù)字都是指乙腈的含量，乙腈含量越大，流動(dòng)相極性越小，出峰越靠前，常用的是10-80的方法，根據(jù)10-80方法的出峰時(shí)間換用不同的方法。有機(jī)流動(dòng)相也可以用甲醇，水相，正模式通常用0.05%的三氟乙酸水溶液，負(fù)模式常用0.02%或乙酸銨鹽水溶液。

特殊HPLC: 堿性柱和中性柱在酸性柱下不能分開的情況下使用 ELSD在紫外顯色弱或者沒有的情況，氣相柱適用于沸點(diǎn)低于300攝氏度的化合物。

使用注意: 峰高在1000-3000mAU之間，出峰時(shí)間在整個(gè)時(shí)間的1/4到3/4，峰寬小于0.5分鐘，顯示的純度是可信度比較大。

查看LCMS步驟:1)、先看MS部分，看有沒有所要離子峰，并且要看清楚峰是否有所需化合物MS信號(hào)，判斷該峰是否掩蓋周圍的峰。2)、再看HPLC部分，看含量有多少，并且要看清楚該化合物是否有強(qiáng)的HPLC信號(hào)，是否掩蓋周圍的峰; 3)、兩者結(jié)合起來看，判斷兩個(gè)峰是否對(duì)應(yīng)，推測(cè)反應(yīng)進(jìn)行的程度和反應(yīng)產(chǎn)生的雜質(zhì)。

注意事項(xiàng)：

1、LCMS的注意要點(diǎn): LCMS是HPLC和MS的結(jié)合，HPLC和MS的出峰時(shí)間是有差異的，由于反應(yīng)液是先通過HPLC分別走出各個(gè)峰，然后分別進(jìn)入MS系統(tǒng)，因此MS的出峰時(shí)間比HPLC的出峰時(shí)間稍微滯后(具體滯后時(shí)間和具體機(jī)器有關(guān))，特別是反應(yīng)液比較復(fù)雜的情況下一定要注意，不要將MS的峰對(duì)應(yīng)了錯(cuò)誤的HPLC峰，導(dǎo)致反應(yīng)判斷錯(cuò)誤。另外不能只靠LCMS檢測(cè)反應(yīng)，特別是不點(diǎn)TLC，直接做LCMS。應(yīng)該結(jié)合其他手段來確定化合物(特別是NMR).

2、正負(fù)離子源分別適合什么分子: 正離子源適用于堿性化合物，如含氮化合物更容易粘附氫正離子，在正離子源中容易出分子離子峰。負(fù)離子源適合酸性化合物，酸性化合物更容易被轟擊掉氫正離子，如酸，酚類化合物。所以要根據(jù)需要監(jiān)測(cè)的化合物的性質(zhì)來決定使用哪種離子源。

3、MS僅為輔助檢測(cè)手段，只可進(jìn)行粗略判斷反應(yīng)液中是否有該化合物，絕對(duì)不能從MS出峰強(qiáng)度來判斷反應(yīng)液中樣品的含量。如果兩個(gè)結(jié)構(gòu)非常類似的化合物，HPLC出峰位置相同時(shí)，并且具有相同的官能團(tuán)的話，可以通過MS出峰強(qiáng)度粗略判斷含量，可以考慮通過點(diǎn)板或HNMR確認(rèn)比例。

4、0-60，5-95，10-80，30-90這些方法是指什么意思: 0-60，5-95，10-80，30-90這些數(shù)字都是指乙腈的含量，乙腈含量越大，流動(dòng)相極性越小，出峰越靠前，常用的是10-80的方法，根據(jù)10-80方法的出峰時(shí)間換用不同的方法。

5、什么樣的HPLC譜圖具有可信度: 峰高在1000-3000之間，出峰時(shí)間在整個(gè)時(shí)間的1/4到3/4，峰寬小于0.5分鐘，顯示的純度是可信度比較大。

6. 其他注意事項(xiàng)：一、甲苯等在LCMS上有吸收峰的試劑作為溶劑的反應(yīng)，在送LCMS監(jiān)測(cè)前一定要先除掉，不然會(huì)影響對(duì)反應(yīng)的判斷，特別是溶劑峰剛好和產(chǎn)物或原料峰出在一個(gè)位置時(shí)。二、當(dāng)點(diǎn)板和LCMS有很大出入時(shí)，LCMS要換其他方法重新監(jiān)測(cè)，切換正負(fù)模式或梯度，防止峰的重疊。三、一般監(jiān)測(cè)前，測(cè)樣要濾膜過濾，所以要確保所測(cè)樣品要完全溶解。