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大家好，一枚被導(dǎo)師突如其來的關(guān)愛沖昏頭腦的研究生上線了~咱就是家人們，你遇到過這樣的事情嗎？ 事情是這樣的，我們學校實行封閉管理以來，就開始想辦法花式“寵”我們。就在剛剛，導(dǎo)師得知我生日到了，要來參加我的生日會?。?！室友問我感動不敢動，我：不敢動！不敢動！對于社恐的我而言，這簡直比在海底撈過生日還可怕！
不曾想，真正到了生日會現(xiàn)場，我的尷尬卻變成了驚喜，原因是：我收到了導(dǎo)師給我寫的萬字細胞培養(yǎng)規(guī)劃，作為生日禮物。關(guān)鍵還是手寫的，我當場感動到落淚！這待遇就問大家有過嗎？為了和大家分享我生日的驚喜，我將其整理成了電子版，在此，和各位養(yǎng)細胞的科研同胞分享~全文如下
xxxx，26歲生日快樂呀！聽說你最近總養(yǎng)死細胞？為了不讓你繼續(xù)浪費我們實驗室為數(shù)不多的經(jīng)費，這篇細胞培養(yǎng)規(guī)劃就當你的生日禮物了。里面包含了細胞培養(yǎng)步驟、細胞污染教訓大全，匯聚了我多年的實驗經(jīng)驗，望你好生珍惜。話不多說，首先你要了解你的細胞。雖說想要摸清自家細胞的習性，只能靠自己。但在此，我將科學的細胞培養(yǎng)步驟教給你，不要再瞎做了?。。?/strong>
細胞培養(yǎng)技術(shù)指的是細胞在體外條件下的生長，在培養(yǎng)的過程中細胞不再形成組織（動物）。培養(yǎng)物是單個細胞或細胞群。細胞在培養(yǎng)時都要生活在人工環(huán)境中，由于環(huán)境的改變，細胞的移動或受一些其他因素的影響，培養(yǎng)時間加長，傳代導(dǎo)致細胞出現(xiàn)單一化型。
將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。移入15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min,棄上清液。加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞密度達到80%~90%時，去培養(yǎng)基，使用10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養(yǎng)箱3分鐘。加人1mlDMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10mlPBS清洗細胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10mlPBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進行計數(shù)，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。細胞密度達到80%~90%時，去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0. 25%EDTA的胰蛋白酶，放入細胞培養(yǎng)箱3分鐘。加入1mIDMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，轉(zhuǎn)速2000rpm，離心2分鐘，棄上清液。加入1ml凍存液（90%血清，10%DMSO)，放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入－80℃冰箱內(nèi)，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放入液氮，可以保存三個月。凍存液的配制：70%的完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO。DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。其次，你要在養(yǎng)細胞過程中學會做筆記，以下是我壓箱底的細胞培養(yǎng)筆記，它就正式交給你了。它包含了幾乎所有你們經(jīng)常問我的問題，你可一定要長點心啊！
新買的細胞應(yīng)及時處理，到手就趕緊做這幾件事：檢測瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴增凍存。
不能使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應(yīng)，造成細胞無法存活。培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳、記住了一旦收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的情況，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，所以，冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。為預(yù)防冷凍管的爆裂導(dǎo)致受傷，在將冷凍管由液氮桶中取出解凍時，須佩戴防護眼鏡和手套。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，以避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，避免水浴水污染細胞。將一般動物細胞離心下來，其離心速率不宜過高，如果想回收動物細胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡。細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？現(xiàn)在絕大多數(shù)實驗室會在解凍細胞后加培養(yǎng)液將DMSO除去。但也有研究者認為除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。如果細胞不對DMSO 敏感又出現(xiàn)了解凍后無法生長或貼附，可以嘗試此方法。細胞培養(yǎng)基的配制和儲存應(yīng)注意什么？細胞培養(yǎng)基配好后，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h，以檢測培養(yǎng)液是否有污染，然后方可用于實驗。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個批號試用效果良好后，就可一次性購入較多數(shù)量的同一批號血清，這樣實驗條件穩(wěn)定，配液時調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內(nèi)用不完造成營養(yǎng)成分損失需要補充，二是量大易造成污染。對于使用培養(yǎng)出來細胞去進行分離制備細胞生長因子、單克隆抗體等應(yīng)該選擇無血清培養(yǎng)基。原代培養(yǎng)的首次傳代應(yīng)注意什么？細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長，不同的細胞有不同的消化時間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時處理，并根據(jù)不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞；首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些，使細胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。冷凍細胞時必須加保護劑。因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存時，細胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細胞損傷，還可引起細胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護劑。這兩種無明顯細胞毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高包膜對水的通透性。冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度？冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。最后，建議你好好研究下細胞污染防治，不要遇到大大小小的污染就跑去煩我和你的師姐師兄了，實在搞不定也歡迎來請教，或是選擇拜一拜文殊菩薩！防治細胞污染前，首先要識破細胞污染的眼力也就是破案的能力。先跟你分享我辨識細胞污染的經(jīng)驗，正確辨識才能很好的解決問題，少走彎路！
案件現(xiàn)場：細胞培養(yǎng)液變渾濁了，經(jīng)常見到是米湯樣，黃色液體。經(jīng)驗教訓：仔細檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時放氣時間足夠、壓力足夠。重點檢查和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染，一定要注意。下次使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象，可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理。案件現(xiàn)場：培養(yǎng)液清亮，倒置顯微鏡下無雜質(zhì)。37 度孵箱培養(yǎng) 2-3 天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)。鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細胞仍可生長，但時間長之后，細胞的活力狀態(tài)變差。經(jīng)驗教訓：可在培養(yǎng)基里加 3u/mL 的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素 D 或雙抗。細胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素 D 或雙抗都于事無補，建議舍棄該污染細胞。將環(huán)境徹底消毒，如果所有細胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材，如果只是個別污染，可能是操作問題，就要注意操作。案件現(xiàn)場：培養(yǎng)液中出現(xiàn)白色或淺黃色漂浮物。經(jīng)驗教訓：真菌污染真的不建議處理，因為孢子容易飄散，可能這瓶沒救過來，又擴大了污染，建議預(yù)防為主，在培養(yǎng)箱的水中加入硫酸銅，就是藍色的那種東西。案件現(xiàn)場：培養(yǎng)液輕微渾濁，顯微鏡下細小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細胞不透亮。經(jīng)驗教訓：污染的可能原因是配液消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等等。也可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時會影響細胞的狀態(tài)，所以在做轉(zhuǎn)染、檢測細胞某項指標前一定要撤去雙抗，以避免影響實驗結(jié)果。案件現(xiàn)場：培養(yǎng)液無異常，顯微鏡下也看不到任何異常物體，細胞形態(tài)看著也正常。但細胞生長的各項指標參數(shù)明顯下降、細胞代謝變慢。經(jīng)驗教訓：支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑0．2um)并獨立生活的微生物。除極有經(jīng)驗的專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨。遇到這類細胞污染，可使用支原體檢測試劑盒進行檢測，如果確定是支原體污染可以選擇支原體去除試劑進行處理。最后的最后，我勸你一定要看完《細胞培養(yǎng)》這本養(yǎng)細胞寶典，這本書對養(yǎng)細胞的人有多重要呢？我就這么說吧，這是每個養(yǎng)細胞的人必看的，不看不好意思進實驗室的那種！我知道你還沒看這本書，現(xiàn)在正趕上解螺旋0元送書活動，請立即放下手中的活，前去排隊領(lǐng)書~
必讀理由一：帶小白進入細胞界的“領(lǐng)路書" 本書作為研究生教學用書,簡要介紹細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)理論，較詳細地敘述哺乳類動物細胞培養(yǎng)必需的用品器材、具體的操作步驟及操作提示等。手把手教你培養(yǎng)細胞，很適合小白入門。必讀理由二：細胞培養(yǎng)屆的“百科全書” 本書除了細胞培養(yǎng)基本知識，細胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和準備工作，細胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基外，本書還補充了一些細胞培養(yǎng)的新技術(shù)，如三維細胞培養(yǎng)技術(shù)、各類腫瘤試驗?zāi)Ｐ?、誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)、細胞克隆形成及雜交瘤細胞制備等。一本書就可以掌握細胞培養(yǎng)術(shù)，高效又全面，可為大家節(jié)省不少搜集資料和經(jīng)驗的時間和精力。必讀理由三：補充了細胞培養(yǎng)新技術(shù) 內(nèi)含細胞培養(yǎng)新技術(shù)：三維細胞培養(yǎng)，誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)，腫瘤干細胞培養(yǎng)。必讀理由四：細胞檢測相關(guān)的儀器分析技術(shù) 內(nèi)含細胞檢測相關(guān)的儀器分析技術(shù)：流式細胞儀、激光掃描共聚焦顯微鏡、掃描電子電鏡、透射電子電鏡、原子力顯微鏡及活細胞工作站。
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