細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞模擬體內(nèi)環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)主要應(yīng)用于以下三個方面：

1.  藥物研究與開發(fā)

? 新藥篩選 

? 疫苗研究與開發(fā) 

? 基因工程藥物研究與開發(fā) 

? 細(xì)胞工程藥物研究與開發(fā) 

2.  基礎(chǔ)研究

? 藥物作用機理

? 基因功能

? 疾病發(fā)生機理

3.  生物制藥

? 疫苗生產(chǎn) 

? 基因工程藥物生產(chǎn)

? 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)

? 細(xì)胞工程藥物生產(chǎn) 

培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式：

貼壁生長：

    必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體組織來源細(xì)胞、上皮細(xì)胞，如下面左圖。

懸浮生長：

于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞，如下面右圖。

 

細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境：

1、溫度環(huán)境：37℃。偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強。

2、氣體環(huán)境： 95%空氣加5%二氧化碳 

3、酸度環(huán)境：大多數(shù)細(xì)胞的適宜PH 為7.2-7.4，細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些。

4、 細(xì)胞培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基。

5、細(xì)胞培養(yǎng)的儀器與設(shè)備：CO₂培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、液氮罐、無菌水、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶液等。

6、無污染環(huán)境：微生物污染一直是細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)。

原代培養(yǎng)：細(xì)胞分離之后至第一次傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)階段。 

傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。

傳代培養(yǎng)的要訣

1.勤觀察

? 每天肉眼觀察培養(yǎng)基顏色是否異常，有無混濁

? 觀察培養(yǎng)基顏色變化速度是否異常：變化過慢意味著細(xì)胞生長過于緩慢；變化過快而細(xì)胞密度并不大，表明有污染的可能性。

? 鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生長速度。

? 觀察培養(yǎng)箱水盤中的水是否干凈。

? 觀察CO₂壓力表。

? 觀察液氮罐內(nèi)液氮體積

2.嚴(yán)格無菌操作 

輕柔：避免機械力損傷細(xì)胞，重懸細(xì)胞時盡量用50ml離心管，通過晃動離心管分散細(xì)胞，盡量避免過力吹打。離心力不可超過300g（普通臺式離心機水平轉(zhuǎn)子1000rpm）。

快速：防止因過分小心導(dǎo)致操作時間過長，增加污染概率。

何時換液？

? pH降低。培養(yǎng)基顏色由紅變橙要警惕，變成黃色之前一定要換液。pH降至6.5時，細(xì)胞停止生長；降至6.0，細(xì)胞失去活性。無法挽救。 

? 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)衰退時須勤換液

? 若培養(yǎng)物密度過低或者生長緩慢，則更換一半培養(yǎng)基。

貼壁細(xì)胞換液的操作：吸出或倒出舊培養(yǎng)基；加入同體積新培養(yǎng)基。 

懸浮細(xì)胞換液操作：將培養(yǎng)液移入離心管中，1000rpm×5min 離心，棄上清，加入新培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。

每代貼附生長細(xì)胞的生長過程：

? 游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時

? 貼壁期：血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團）

? 潛伏期：此時細(xì)胞有生長話動，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時。

? 對數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。 

? 停止期（平臺期）細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。  機制：接觸抑制、密度抑制。盡量避免細(xì)胞進入平臺期。 

何時傳代？

在對數(shù)生長末期傳代，不可在潛伏期傳代。

貼壁細(xì)胞何時傳代？

? 細(xì)胞密度，90％匯合度。若繼續(xù)放置超過24h，細(xì)胞將脫離細(xì)胞周期，再接種需要很長時間才能恢復(fù)。

? 須頻繁更換培養(yǎng)基時。

? 理想的傳代頻率：1:2～1:4傳代，接種密度10⁴～10⁵/ml， 每7天傳代一次。 

? 常規(guī)傳代最好依據(jù)嚴(yán)格的時間表進行。

貼壁生長細(xì)胞傳代方法

? 吸盡培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。

? 用PBS（或Hank’s）洗滌細(xì)胞兩次，吸光緩沖液。

? 加入0.25％的胰蛋白酶液（0.1ml/cm²）到培養(yǎng)瓶細(xì)胞面對側(cè)。 

? 翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使胰酶完全覆蓋細(xì)胞層，靜置2-10 min（室溫或37度，顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測，至細(xì)胞變圓隆起）。

? 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入含血清培養(yǎng)基以終止消化反應(yīng)。

? 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)基，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。

? 收集細(xì)胞懸液于離心管內(nèi)，1000rpm×5min離心，棄上清。

? 加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

? 吸取適量細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

? 加適量新鮮培養(yǎng)基于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。

? 將新培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

懸浮細(xì)胞傳代

? 細(xì)胞密度：超過1×10⁶/ml，需要頻繁更換培養(yǎng)基時。

? 離心法傳代：離心（1000rpm×5min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后混勻傳代。

細(xì)胞計數(shù)

? 制備單細(xì)胞懸液，吹打均勻后，轉(zhuǎn)移一小部分樣本（500ul）至1.5mlEP管中，加入等體積0.4％臺盼藍(lán)染液。

? 75％酒精清洗計數(shù)板表面，注意不要劃傷計數(shù)表面。

? 將已染色待測細(xì)胞懸液吹打均勻，然后用移液器吸取20ul細(xì)胞懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，液體剛好流到計數(shù)板凹槽邊緣。注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

? 將計數(shù)板平放在顯微鏡載物臺上計數(shù)。

? 統(tǒng)計角上四個大格的活細(xì)胞數(shù)。對于壓線細(xì)胞的處理：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右細(xì)胞團按照一個細(xì)胞計。結(jié)果計算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝ （ 四個大格子細(xì)胞數(shù)之和/4) ×10⁴×2

細(xì)胞凍存

? 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。

? 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中，對細(xì)胞最大傷害的是細(xì)胞內(nèi)水形成的冰晶。所以最重要的就是要減少冰晶的形成。

1. 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

? 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。        

? 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

2. 加入細(xì)胞保護劑（DMSO、甘油等）

常用的低溫保護劑是二甲基亞砜（DMSO），它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。有毒！強滲透性?？梢詽B入乳膠手套。

? 使用濃度：5％～10％，一般用10％。

? 復(fù)蘇時需1:20稀釋，從10％稀釋到0.5％。

? 如果進出細(xì)胞速度過快，會對細(xì)胞產(chǎn)生滲透性損傷。所以凍存和復(fù)蘇時要盡量降低細(xì)胞內(nèi)外DMSO的濃度差。

? DMSO與細(xì)胞混合后室溫下不能放置超過30分鐘

? 溶于水時放熱，對細(xì)胞損害大。不能將純DMSO直接加入細(xì)胞懸液。

? 少數(shù)細(xì)胞系對DMSO敏感，凍存時改用甘油。

滿足凍存標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞

? 形態(tài)學(xué)健康

? 生長良好

? 處于對數(shù)生長晚期

? 無污染。

? 細(xì)胞濃度至少1×10⁶/ml，最好1×10⁷/ml。

? 溶液成分：40％血清＋5%~10％DMSO＋50％合成培養(yǎng)基。血清含量越高，對細(xì)胞保護越好。含量最高可提高到90％。

冷凍方法一

? 先將凍存管放入4℃冰箱，約30min

? 接著置于-20℃冰箱，約30-60min

? 置于-80 ℃超低溫冰箱中放置過夜

? 置于液氮罐中長期保存

? —20 ℃放置時間不可過長，否則細(xì)胞存活率低?？陕匀ミ@一步，4 ℃30min后直接放入-80 ℃超低溫冰箱

冷凍方法二

? 將凍存管放于程序降溫盒中。

? 將程序降溫盒置于－80 ℃超低溫冰箱中放置過夜。

? 置于液氮罐中長期保存。

程序降溫盒

細(xì)胞復(fù)蘇的方法

? 從液氮中取出冷凍管，迅速放入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分鐘左右），水面不可沒過蓋子，防止水污染細(xì)胞。注意，凍存管可能爆炸！

? 培養(yǎng)液稀釋至原體積的20倍。滴加，10ml/2分鐘，先慢后快，邊加邊搖晃培養(yǎng)瓶。防止DMSO滲透性損傷。

細(xì)胞的運送

   凍存細(xì)胞用干冰運輸，鮮活細(xì)胞要灌滿培養(yǎng)基。

細(xì)胞庫推薦

1.American Type Culture Collection(ATCC)  https://www./

2.中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫http://www./

3.中科院昆明細(xì)胞庫 http://www./

4.中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心) http://sub./cctcc/