細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等多種學(xué)科研究的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。通過細(xì)胞培養(yǎng)可以直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)，聯(lián)合各種技術(shù)進(jìn)行各種物理、化學(xué)生物的研究。

一、準(zhǔn)備工作

細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作是很重要，也很復(fù)雜的一項(xiàng)工作，應(yīng)予以重視。

1. 無菌室及無菌操作臺(tái)
   無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70% ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在臺(tái)面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70% ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。

2. 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

2.1玻璃器皿的清洗、干燥、消毒：
1）細(xì)胞培養(yǎng)的和主要是玻璃容器與pasteur pipet，其它均為塑料無菌制品。
2）實(shí)驗(yàn)用的玻璃容器與pasteur pipet使用前都要進(jìn)行清洗。新購(gòu)玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開始使用。
3）用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
4）實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven中烘干。實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet以干熱滅菌170℃, 4 小時(shí)。

2.2培養(yǎng)容器：種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。

2.3 培養(yǎng)基的配制及分裝

1）液體培養(yǎng)基貯存于4℃ 冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37℃ 水槽中溫?zé)帷Ｒ后w培養(yǎng)基（加血清）存放期為六個(gè)月，期間glutamine可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添加適量glutamine。

2）粉末培養(yǎng)基(以1 升為例)之配制體積為900 ml，pH為7.2-7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。高壓滅菌后添加血清。

3）為避免培養(yǎng)基污染，可以在培養(yǎng)基中添加雙抗(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。若實(shí)驗(yàn)不或細(xì)胞不允許，可將培養(yǎng)基少量分裝。操作均在無菌條件下進(jìn)行。

2.4 抗生素

1）ATCC細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素

2）培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze通過污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。

3）寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask時(shí)，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。

4）若要檢測(cè)mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin會(huì)抑制mycoplasma生長(zhǎng)。

5）去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin 250ug/ml, bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。

6）抗生素使用種類與濃度：

2.5血清

1）血清必須貯存于–20～–70℃，若存放于4℃，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。如果一次無法用完一瓶，可將40～45ml 分裝于無菌50ml離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。

2）一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。

3）瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

3.培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試

1）CO2鋼瓶之CO2壓力。

2）CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度（5%）、溫度（37℃）、及更換水盤的無菌水（可添加消毒劑（Zephrin 1:750）每周更換）。

3）無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時(shí)/HEPA)。

4. 其他試劑的配制及滅菌

4.1 PBS（PH7.4，1L）：稱取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可0.01M 。高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，室溫放冷，置于4℃或常溫保存。

4.2 無菌水：雙蒸水高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，室溫放冷，常溫保存。

二、細(xì)胞傳代培養(yǎng)

工作人員穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套進(jìn)入無菌室，小心取用實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。對(duì)于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)（至少Class II）。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。

細(xì)胞生長(zhǎng)至高密度時(shí)，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細(xì)胞種類而異。

具體步驟：

粘附細(xì)胞：

1. 吸掉舊培養(yǎng)液。

2. 用PBS洗滌細(xì)胞一至二次。

3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液)。

4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

懸浮細(xì)胞：

1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。

2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

三、細(xì)胞冷凍保存

步驟：

1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。

2.  配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。

3. 按細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液((約0.1 ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。

4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 10⁶ cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。

5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30分鐘→ -80℃ 16～18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于含異丙醇的程序降溫盒中，直接放入-80℃，1～2天后再放入液氮槽中。

注意事項(xiàng)：

1. 欲冷凍保存的細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。

2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞仍保有其特有性質(zhì)。

3. 冷凍保護(hù)劑DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無菌且無色，以5~10 ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。

4. 冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。

   
   

四、細(xì)胞復(fù)蘇

步驟：

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

2.  從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；
   

3. 離心， 1000rpm，5min；

4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

   注意事項(xiàng)：
   1 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
   2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉。
   3 將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

五、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試

1. 存活測(cè)試之步驟為dye exclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。

2. 步驟：

   2.1. 取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue (or Erythrosin bluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

   2.2. 取少許混合液(約15μl) 自細(xì)胞計(jì)數(shù)版上方凹槽加入，于100倍倒立顯微鏡下觀察，或于細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中自動(dòng)檢測(cè)活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色- Erythrosinbluish)

   2.3. 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，最后乘以10⁴，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。

   2.4 大格*細(xì)胞總數(shù)x 2 x 10⁴/4= 細(xì)胞數(shù)/ml