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編譯：石石，編輯：十九、江舜堯。 原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。 導(dǎo)讀CYLD是一種著名的抑癌基因，在乳腺癌、結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤等多種腫瘤類型中均下調(diào)。CYLD在人黑色素瘤細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄抑制因子SNAIL 1所抑制，從而增加細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移潛能。該抑癌基因具有獨(dú)特的功能，研究者構(gòu)建了新的小鼠模型TG(Grm 1)CYLD-/-。在此，研究者證明CYLD缺乏癥會導(dǎo)致黑色素瘤的早期發(fā)病和加速腫瘤的發(fā)生。首先，RNA測序數(shù)據(jù)揭示了CYLD在調(diào)控涉及增殖、遷移和血管生成的基因中的潛在作用。用TG(Grm 1)CYLD-/-和TG(Grm 1)CYLD+/+小鼠原發(fā)和轉(zhuǎn)移黑色素瘤細(xì)胞株進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CYLD的丟失促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖和遷移，以及在體外的克隆原性。此外，通過管狀形成試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)和mRNA表達(dá)分析，研究者可以發(fā)現(xiàn)CYLD基因敲除可以增加血管生成模擬和(淋巴)血管生成。總之，研究者的發(fā)現(xiàn)揭示了CYLD在淋巴血管生成過程中的新功能方面，并證明了它在黑色素瘤進(jìn)展的早期過程中的重要性。原名：Loss of CYLD accelerates melanoma development and progression in the Tg(Grm1) melanoma mousemodel譯名：在TG（Grm1）黑色素瘤小鼠模型中，CYLD的缺失加速了黑色素瘤的發(fā)展和進(jìn)展通訊作者：Anja-Katrin Bosserhoff通訊作者單位：德國埃爾蘭根-紐倫堡大學(xué)生物化學(xué)研究所、解剖學(xué)研究所CYLD的缺失加速了黑色素瘤的發(fā)生，促進(jìn)了體內(nèi)腫瘤的生長 為了研究CYLD在體內(nèi)黑色素瘤發(fā)生中的作用，采用C57BL/6 CYLD基因敲除小鼠與TG(Grm1)小鼠雜交。然后對生成的TG(Grm 1)CYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD?/?小鼠進(jìn)行了發(fā)病分析。(圖1A)。與TG(Grm 1)CYLD+/+對照組相比，TG(Grm 1)CYLD-/-小鼠發(fā)生黑色素瘤的時間明顯提前。CYLD+/+小鼠在出生后18周出現(xiàn)腫瘤，而 TG(Grm1)CYLD?/?小鼠10周后已經(jīng)觀察到了。此外，在腫瘤發(fā)生后9周隨訪耳部、尾部和肛門黑色素瘤生長的進(jìn)展情況。在這里，一個從最小到極端腫瘤生長的評分被用來量化黑色素瘤的進(jìn)展。結(jié)果表明，與CYLD野生型小鼠相比，CYLD基因敲除小鼠的腫瘤生長速度增加(圖1B)。此外，Grm1 mRNA在TG(Grm 1)C淋巴結(jié)組織中的表達(dá)將GYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD?/?小鼠作為黑色素瘤細(xì)胞擴(kuò)散的標(biāo)記物。在此，77天齡的CYLD?/?小鼠淋巴結(jié)中Grm 1表達(dá)明顯增強(qiáng)，而CYLD+/+小鼠則未檢測到黑色素瘤細(xì)胞。RNA測序顯示CYLD相關(guān)基因調(diào)節(jié)為了明確CYLD依賴的解除管制基因及其導(dǎo)致CYLD基因敲除小鼠腫瘤生長增加的潛在機(jī)制，進(jìn)行了RNA測序。Tg(Grm1)Cyld+/+與Tg(Grm1)Cyld?/?的原發(fā)性腫瘤組織用于確定基因表達(dá)譜。RNA測序顯示，與野生型組織相比，CYLD基因敲除組織中有398個上調(diào)基因和101個下調(diào)基因。為了確定解除管制的基因?qū)ν氛{(diào)控的影響，對差異表達(dá)的基因進(jìn)行分析，并將其分類為GO項(xiàng)。KEGG路徑的分類這些方法揭示了許多已知的癌癥解除管制的途徑，例如TGF-β和Rap1(表1)。在此，研究者使用Smad2/3響應(yīng)報告基因測定證實(shí)了與CYLD-野生型細(xì)胞系相比，在CYLD-敲除中TGFbeta信號的上調(diào)(補(bǔ)充圖。S2）。這是一致的有幾種TGFβ靶基因如BMP2K或SMURF1的差異表達(dá)。有趣的是，根據(jù)生物過程進(jìn)行的分類會產(chǎn)生細(xì)胞增殖、遷移和血管生成的調(diào)節(jié)。(表2)。TG(Grm 1)黑色素瘤細(xì)胞系的構(gòu)建在RNA測序結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步了解CYLD在惡性黑色素瘤中的抑癌作用，并進(jìn)一步了解tg(Grm 1)CYLD通配型和tg(Grm 1)CYLD-基因敲除鼠細(xì)胞株在惡性黑色素瘤中的抑癌作用。為此，從尾部和耳部分離出原發(fā)黑色素瘤組織的黑色素瘤細(xì)胞，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑色素瘤細(xì)胞（圖1c）。由于所有細(xì)胞系在幾代后色素沉著消失(圖1d)，通過電子顯微鏡觀察到所有被測細(xì)胞系的黑色素體，證實(shí)了黑色素細(xì)胞的起源（圖1e）。此外，qRT-PCR分析顯示，培養(yǎng)的TG(Grm 1)細(xì)胞系與小鼠小腦(陽性對照，設(shè)為1)具有相當(dāng)?shù)腉rm 1 mRNA表達(dá)水平，而小鼠b16黑色素瘤和黑色素A細(xì)胞株(陰性對照)Grm 1卻表達(dá)極低(圖1F)。此外，GRM 1在CYLD-野生型和CYLD-基因敲除細(xì)胞系中的表達(dá)是相當(dāng)?shù)?。這表明，具有相同遺傳背景的GRM1產(chǎn)生的細(xì)胞攜帶并表達(dá)由dct啟動子控制的Grm 1轉(zhuǎn)基因，因此它們具有黑素細(xì)胞起源。圖1 黑色素瘤在體內(nèi)的發(fā)生和進(jìn)展以及TG(Grm 1)黑色素瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生。
1a:黑色素瘤發(fā)病于TG(Grm 1)CYLD?/?(n=15)和TG(Grm 1)CYLD+/+小鼠(n=18)。1b:腫瘤發(fā)生后CYLD基因敲除小鼠與CYLD野生型小鼠的腫瘤進(jìn)展比較。評價尾部、耳部和肛周區(qū)腫瘤生長進(jìn)展的分級系統(tǒng)在腫瘤發(fā)作后的9周內(nèi)，如前面所述1c. 從TG(Grm 1)CYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD?/?小鼠中分離培養(yǎng)小鼠原發(fā)黑色素瘤(耳、尾)黑色素瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織(淋巴結(jié))。1d: 在幾個通道之后觀察到細(xì)胞系的色素沉積損失。1e: 用透射電鏡觀察原發(fā)腫瘤細(xì)胞株和CYLD+/+和CYLD?/?小鼠轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的球體，可見黑色素小體(箭頭)。1f: 用qRT-PCR法檢測10株TG(Grm 1)細(xì)胞株Grm 1 mRNA的表達(dá)，并與小鼠小腦對照(設(shè)置為1)進(jìn)行比較。使用Melana和B16作為陰性對照，β-actin作為參考基因。1g: 采用western blot方法檢測CYLD蛋白水平，確定CYLD基因型。以GAPDH為加載對照。(*p<0.05)CYLD-缺乏癥可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞株的增殖、集落形成和遷移在從TG(GRM1)CYLD-野生型和TG(GRM1)CYLD基因敲除小鼠中產(chǎn)生黑素瘤細(xì)胞系后，用體外功能分析法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。首先，使用XCELLigence系統(tǒng)體外實(shí)時增殖試驗(yàn)測量增殖，這一分析表明，轉(zhuǎn)移性tg(Grm 1)CYLD?/?細(xì)胞與原代腫瘤細(xì)胞相比，其倍增時間明顯縮短，而原代腫瘤細(xì)胞的增殖潛能則明顯降低，而有或不表達(dá)CYLD的原發(fā)腫瘤細(xì)胞的增殖潛能是基本相當(dāng)?shù)摹?/span>(圖2A)。圖2 黑色素瘤的擴(kuò)散和遷移能力。（a-c增殖）b.與TG(Grm 1)CYLD+/+小鼠細(xì)胞系相比，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性TG(Grm 1)CYLD?/?細(xì)胞的遷移明顯增加。 c.用TG(Grm 1)CYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD?/?系統(tǒng)對原發(fā)黑色素瘤組織(PT)和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(LN)細(xì)胞進(jìn)行了分析(細(xì)胞指數(shù)=測量阻抗的相對變化以表示細(xì)胞狀態(tài))。d.在克隆形成分析中，分別顯示了兩種基因型的每一個尾部和淋巴結(jié)細(xì)胞系的代表性圖像，并對其進(jìn)行了定量分析。(*p<0.05)對高轉(zhuǎn)移傾向的黑色素瘤細(xì)胞其遷移潛力進(jìn)行了分析，與TG(Grm 1)CYLD+/+小鼠細(xì)胞系相比，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性TG(Grm 1)CYLD?/?細(xì)胞的遷移明顯增加 (圖2B)。可以看出細(xì)胞貼壁不受CYLD的影響(圖2C)。此外，對克隆形成潛能的分析表明，與CYLD相比，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性CYLD缺陷TG(Grm 1)細(xì)胞的單個細(xì)胞形成集落的能力增強(qiáng)。CYLD的喪失加速了血管生成的過程，并促進(jìn)了(淋巴)血管的生成。由于血管生成模擬實(shí)驗(yàn)是黑色素瘤的一個眾所周知的特征，本文分析了CYLD對黑色素瘤細(xì)胞形成血用原發(fā)黑色素瘤和黑色素瘤轉(zhuǎn)移的小鼠細(xì)胞系進(jìn)行試管形成試驗(yàn)(圖3A)。所有的TG(Grm 1)CYLD?/?細(xì)胞株都能構(gòu)建出血管結(jié)構(gòu)管的影響。為了更詳細(xì)地描述這一有趣的差異，研究者研究了CYLD缺乏癥對血管生成的影響。研究顯示，TIMP2(金屬蛋白酶2的組織抑制劑)、TIMP3(金屬蛋白酶3的組織抑制劑)和ADAMTS5(一種去集成素和金屬蛋白酶與凝血酶)的表達(dá)Ospin1型基序，5)減少黑素瘤細(xì)胞中的血管生成。因此，對這些抗血管生成標(biāo)記物的mRNA表達(dá)模式進(jìn)行了檢測。雖然差異不顯著，但TG（Grm1）Cyld-/-細(xì)胞株與TG（Grm1）Cyld+/+細(xì)胞相比，每個標(biāo)記的表達(dá)較弱（圖3b）。除血管形成外，尤其是淋巴管生成在黑色素瘤進(jìn)展中也具有特別重要的意義。黑色素瘤細(xì)胞主要通過淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)中研究者旨在了解CYLD在此過程中調(diào)制的相關(guān)因素。首先，研究者利用特異性淋巴組織Lyve-1，（即一種特殊的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物），通過免疫熒光染色，研究了CYLD在小鼠TG(Grm 1)CYLD+/+和CYLD?/?黑色素瘤組織中淋巴管形成中的作用（圖3c）。定量分析顯示，與CYLD-野生型小鼠相比，CYLD缺陷小鼠的黑色素瘤組織中淋巴管的數(shù)量顯著增加，表明CYLD可能是黑色素瘤淋巴血管生成的調(diào)節(jié)因子。用定量RT-PCR方法檢測了已知基因的mRNA表達(dá)模式淋巴管形成標(biāo)記物在痣和腫瘤組織中的模型(圖3d)。這提示CYLD缺陷小鼠痣組織中VEGF-C、podoplanin、Lyve-1和Prox-1 mRNA表達(dá)增加。雖然在腫瘤組織中只有Lyve-1的表達(dá)明顯上調(diào)，CYLD丟失后幾乎所有標(biāo)志物都有較高表達(dá)的顯著趨勢，這支持CYLD在調(diào)節(jié)淋巴管生成中的作用。圖3 CYLD丟失增強(qiáng)血管生成模擬和(淋巴)血管生成
管狀形成實(shí)驗(yàn)顯示，在CYLD?/?細(xì)胞中形成血管結(jié)構(gòu)的能力增強(qiáng)。通過QRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與CYLD野生型細(xì)胞相比，CYLD缺陷細(xì)胞株中抗血管生成標(biāo)記Adamts 5、TIMP 2和TIMP 3的mRNA表達(dá)降低。本研究建立小鼠模型，研究CYLD缺乏癥對黑色素瘤的影響。該模型是在TG(Grm 1)黑色素瘤小鼠模型的背景下產(chǎn)生的，該模型顯示了自發(fā)黑色素瘤的發(fā)展。眾所周知，CYLD在人類黑色素瘤中具有抑制腫瘤的作用。以前的研究，包括研究者小組的研究，能夠?qū)?/span>CYLD的丟失與體外增殖、侵襲和體內(nèi)腫瘤的進(jìn)展聯(lián)系起來。然而，有一些出版物報道說，CYLD在人黑色素瘤細(xì)胞中的重新表達(dá)的遷移潛能減弱了。一項(xiàng)研究描述了用siRNA治療CYLD表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞時遷移減少的情況，此外在淋巴管血管生成過程中，CYLD在轉(zhuǎn)移中的作用很差，之前未對其進(jìn)行分析。RNA序列分析顯示，CYLD缺陷型和野生型小鼠黑色素瘤的發(fā)生有很大的差異，發(fā)現(xiàn)CYLD缺陷型黑色素瘤組織中有許多解除管制的基因。有人證明，通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β信號在纖維化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。通過對RNA-seq數(shù)據(jù)分析，證實(shí)了CYLD與轉(zhuǎn)化生長因子-β信號的聯(lián)系，并通過在CYLD基因敲除與CYLD野生型細(xì)胞和組織中顯示較高的β途徑活性和SMAD靶基因的表達(dá)來證實(shí)了兩者之間的聯(lián)系。結(jié)果分析進(jìn)一步證實(shí)了CYLD在調(diào)節(jié)增殖和遷移方面的相關(guān)性，就像在人類黑色素瘤中已經(jīng)描述的那樣。然而有趣的是，這也為CYLD在血管生成中的重要作用提供了初步線索，即由已有血管形成的新血管。根據(jù)RNA序列測定數(shù)據(jù)，用新產(chǎn)生的TG(Grm 1)黑色素瘤細(xì)胞株進(jìn)行體外研究，發(fā)現(xiàn)CYLD基因敲除細(xì)胞株具有較強(qiáng)的增殖、遷移和克隆原性。這些數(shù)據(jù)與先前發(fā)表的人類黑色素瘤細(xì)胞系的結(jié)果一致，同時也證明了所產(chǎn)生的細(xì)胞株是CYLD腫瘤抑制功能未來研究的有效模型。血管生成是黑色素瘤中一個被廣泛研究的過程，它可以幫助腫瘤保證營養(yǎng)和氧氣的供應(yīng)，并促進(jìn)轉(zhuǎn)移。黑色素瘤患者多項(xiàng)血管生成因子升高，血管生成率高與黑色素瘤患者預(yù)后差有關(guān)。眾所周知，黑色素瘤細(xì)胞具有血管模擬的內(nèi)在能力。在這項(xiàng)研究中，研究者發(fā)現(xiàn)結(jié)論：CYLD通過抑制腎小管的形成，對黑色素瘤細(xì)胞的血管生成具有調(diào)節(jié)作用。矛盾的是，另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示：CYLD表達(dá)的下調(diào)對內(nèi)皮細(xì)胞的形成和萌發(fā)有一定的抑制作用。這種差異提示CYLD在不同的細(xì)胞類型中具有特定的功能，并支持CYLD在黑色素瘤細(xì)胞血管模擬中的作用。 研究者的數(shù)據(jù)表明，CYLD的缺失可能通過抑制TIMP-2、TIMP-3和ADAMTS 5等多種抗血管生成因子的表達(dá)而導(dǎo)致黑色素瘤血管生成。TIMP3是血管內(nèi)皮生長因子介導(dǎo)的血管形成的拮抗劑，ADAMTS 5可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的形成。TIMP 2可降低小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16的成管能力。此外，TIMP-2在食管癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能是通過抑制MMP的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。有趣的是，包括VEGF-A與野生型CYLD相比，一種催化活性的CYLD(CYLD C/S)的重新表達(dá)并沒有導(dǎo)致血管生成因子水平的降低。此外，只有CYLD的過度表達(dá)才能降低人鱗狀細(xì)胞癌的血管生成。因此，CYLD的脫泛素酶功能顯得尤為重要。來調(diào)節(jié)血管生成。研究表明，CYLD通過脫泛素酶功能參與了外膜成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程，從而在血管重構(gòu)中發(fā)揮作用。研究者進(jìn)一步詢問CYLD是否也影響淋巴結(jié)構(gòu)的形成。在先前的研究中，標(biāo)記物L(fēng)yve-1的建立表明，大量淋巴管對一般的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移有預(yù)測作用。此外，淋巴管數(shù)量的增加與預(yù)后不良有關(guān)。有趣的是，CYLD敲除小鼠的黑色素瘤組織顯示出比對照組更多的LYVE-1陽性血管，因此CYLD參與了淋巴血管生成的過程。這進(jìn)一步證實(shí)了通過觀察CYLD缺乏癥可促進(jìn)幾種已建立的淋巴血管生成標(biāo)記物的表達(dá)。值得注意的是，在研究者的研究中，CYLD缺陷小鼠的良性痣組織幾乎所有研究指標(biāo)的表達(dá)都顯著增強(qiáng)。基于研究者的研究，CYLD的缺失正向影響黑色素瘤淋巴管的形成和轉(zhuǎn)移，尤其是在黑色素瘤進(jìn)展的早期過程中，是支持CYLD的重要作用。在血管生成和淋巴血管生成的背景下，通過分析對RNA測序數(shù)據(jù)的分析進(jìn)一步支持了CYLD在這些過程中的作用。在測序數(shù)據(jù)中，有幾條與癌癥有關(guān)的途徑和過程受到不同的調(diào)控，這些途徑和過程與血管和淋巴管的形成有關(guān)。此外，體外數(shù)據(jù)也提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，證明CYLD缺陷促進(jìn)了已經(jīng)被描述的參與血管緊張素過程的幾個基因和信號通路的表達(dá)。在淋巴管血管生成方面也是如此。所有這些結(jié)果支持了研究者關(guān)于CYLD在淋巴/血管生成中的重要作用的假說。綜上所述，新建立的小鼠模型及由此產(chǎn)生的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移細(xì)胞系為進(jìn)一步研究CYLD在惡性黑色素瘤中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。本文研究了CYLD在黑色素瘤血管生成模擬和淋巴管新生中的新功能。此外，研究者的研究結(jié)果顯示了CYLD對黑色素瘤發(fā)病的重要影響，進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，以及它的多種腫瘤抑制功能。
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