Molecular, clinicopathological, and immune correlates of LAG3 promoter DNA methylation in melanoma

黑色素瘤中LAG3啟動(dòng)子的分子，臨床病理和免疫相關(guān)性與DNA甲基化的關(guān)系

一、研究背景

隨著免疫檢查點(diǎn)封鎖(ICB)的出現(xiàn)，癌癥的免疫治療已成為晚期癌癥治療的主要支柱。為了克服甚至防止其治療抗性，將另外的免疫檢查點(diǎn)抑制受體評(píng)估為免疫治療的靶標(biāo)。共受體淋巴細(xì)胞激活基因3(LAG3，LAG-3，CD223)是免疫檢查點(diǎn)抑制免疫療法的一個(gè)有吸引力的新靶標(biāo)。LAG3表達(dá)與更好的總體生存率有關(guān)。但到目前為止，對(duì)LAG3的表觀遺傳調(diào)控知之甚少，同時(shí)，關(guān)于黑色素瘤及其微環(huán)境中LAG3 DNA甲基化的生物學(xué)和臨床意義了解甚少。

二、研究思路

三、結(jié)果解析

1、LAG3 mRNA表達(dá)與甲基化的相關(guān)性

通常啟動(dòng)子甲基化會(huì)使轉(zhuǎn)錄基因沉默。將LAG3基因內(nèi)16個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平與TCGA中468例黑色素瘤樣本的RNA-Seq表達(dá)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)起來以驗(yàn)證LAG3的表達(dá)是受DNA甲基化控制的假說。使用Infinium HumanMethylation450 BeadChip來分析LAG3基因的甲基化。

在通過Human Methylation450 BeadChip磁珠靶向的16個(gè)不同基因座上確定了LAG3甲基化。圖1顯示的是12號(hào)染色體，位置6,771,547-6,779,861，包括LAG3基因，其轉(zhuǎn)錄本和調(diào)控元件(啟動(dòng)子，啟動(dòng)子側(cè)翼和CTCF結(jié)合位點(diǎn))，研究的序列。說明在LAG3基因的基因結(jié)構(gòu)中，有兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本LAG3-201和LAG3-202具有相同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的區(qū)域預(yù)測(cè)了extended promoter和它的側(cè)翼的位置。CpG位點(diǎn)3至12位于啟動(dòng)子中。磁珠1和2探測(cè)到的CpG位點(diǎn)位于上游啟動(dòng)子側(cè)翼，包括一個(gè)promoter-embedded的CTCF結(jié)合位點(diǎn)。CpG位點(diǎn)13和14位于基因體內(nèi)。CpG位點(diǎn)15和16位于下游CTCF結(jié)合位點(diǎn)。

在16個(gè)分析的磁珠中，有12個(gè)LAG3甲基化與基因表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)(表1)。黑色素瘤組織中的甲基化水平和mRNA表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)性，在第8珠靶向的CpG位點(diǎn)最明顯，其被顯示在圖2A。

有趣的是，LAG3甲基化與基因表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)的11個(gè)CpG位點(diǎn)位于啟動(dòng)子和上游啟動(dòng)子側(cè)翼中(磁珠1至11)。相反，位于基因體中的磁珠14和與CTCF結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的磁珠15呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。磁珠15在圖2B中顯示。

2、LAG3甲基化和mRNA表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

已知LAG3可作為在白細(xì)胞上表達(dá)的抑制性檢查點(diǎn)受體，假設(shè)LAG3的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的水平相關(guān)。根據(jù)這個(gè)假設(shè)，研究了TCGA隊(duì)列中LAG3甲基化和mRNA表達(dá)與淋巴細(xì)胞評(píng)分和白細(xì)胞分?jǐn)?shù)的相關(guān)性。如預(yù)期，LAG3 mRNA表達(dá)與淋巴細(xì)胞評(píng)分和白細(xì)胞分?jǐn)?shù)之間存在顯著的正相關(guān)(表1，圖3)。因此，以磁珠1至13為靶標(biāo)的CpG位點(diǎn)主要位于啟動(dòng)子區(qū)域，淋巴細(xì)胞評(píng)分和白細(xì)胞分?jǐn)?shù)與LAG3甲基化呈顯著負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究有關(guān)樣品腫瘤含量的TCGA數(shù)據(jù)。在這里，LAG3 mRNA表達(dá)和甲基化模式與TILs中觀察到的模式相反：腫瘤組織的純度和腫瘤細(xì)胞含量(占腫瘤細(xì)胞核的百分比)與LAG3 mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，腫瘤組織的純度和腫瘤細(xì)胞含量與磁珠1至13靶向的CpGs(腫瘤組織的純度)和磁珠1至12靶向的CpGs的LAG3甲基化顯著相關(guān)(圖3)。靶向位于基因體內(nèi)的CpG位點(diǎn)的磁珠14和CTCF結(jié)合位點(diǎn)的CpG的磁珠15，顯示LAG3甲基化與腫瘤組織的腫瘤細(xì)胞含量/純度之間呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)，檢測(cè)到LAG3甲基化與白細(xì)胞分?jǐn)?shù)和淋巴細(xì)胞評(píng)分顯著正相關(guān)。綜上，證明了珠1-13靶向的低甲基化區(qū)域與LAG3 mRNA表達(dá)的增加有關(guān)。磁珠1至12靶向的高甲基化區(qū)域與腫瘤細(xì)胞含量和純度相關(guān)，磁珠14和15靶向的高甲基化區(qū)域與淋巴細(xì)胞分?jǐn)?shù)和白細(xì)胞分?jǐn)?shù)相關(guān)。

為了根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)跟蹤結(jié)果，建立了一個(gè)由120例黑色素瘤樣本(UHB隊(duì)列)組成的驗(yàn)證隊(duì)列。隨后使用針對(duì)CpG位點(diǎn)8和4的qMSP測(cè)定法(圖1)，以顯示在TCGA隊(duì)列分析中高度顯著的相關(guān)性將甲基化水平與淋巴細(xì)胞評(píng)分關(guān)聯(lián)起來，使用組織病理學(xué)檢查進(jìn)行評(píng)估。同時(shí)，還分別在使用qMSP assay 4的114例和使用qMSP assay 8的117例黑色素瘤樣品獲得甲基化和組織病理學(xué)分析的有效結(jié)果。觀察到8珠(qMSP assay 8)靶向的CpG位點(diǎn)的甲基化與淋巴細(xì)胞評(píng)分和白細(xì)胞分?jǐn)?shù)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)。因此，不僅證明了CpG位點(diǎn)8的甲基化與腫瘤細(xì)胞分?jǐn)?shù)之間呈正相關(guān)，CpG位點(diǎn)4的甲基化(qMSP assay 4)與淋巴細(xì)胞得分和白細(xì)胞分?jǐn)?shù)之間顯著負(fù)相關(guān)，也證實(shí)了從TCGA數(shù)據(jù)獲得的結(jié)果。

3、LAG3甲基化和mRNA表達(dá)與免疫細(xì)胞亞群的相關(guān)性

腫瘤組織由不同的成分組成，包括腫瘤細(xì)胞，基質(zhì)和不同的免疫細(xì)胞亞群將B細(xì)胞，CD4+和CD8+T細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的RNA-Seq signatures與LAG3甲基化水平相關(guān)聯(lián)(圖3)。初步結(jié)果顯示，LAG3啟動(dòng)子低甲基化與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞水平的升高相關(guān)，而免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)與下游CTCF結(jié)合位點(diǎn)的高甲基化相關(guān)對(duì)單個(gè)免疫細(xì)胞亞群的分析證實(shí)了LAG3啟動(dòng)子低甲基化和LAG3 mRNA水平與促炎和活化的免疫細(xì)胞亞群之間存在顯著相關(guān)性，尤其是活化的NK細(xì)胞，CD8 +T細(xì)胞和活化的CD4+記憶細(xì)胞，這與已發(fā)表的關(guān)于活化免疫細(xì)胞上LAG3表達(dá)的結(jié)果一致：LAG3在活化的免疫細(xì)胞上的表達(dá)。

LAG3啟動(dòng)子的低甲基化和mRNA表達(dá)與Tregs的RNA-seq signature相關(guān)。Tregs已被證明在動(dòng)態(tài)水平表達(dá)LAG3取決于激活狀態(tài)，并且具有黑色素瘤中描述的高水平觀察到促炎性M1巨噬細(xì)胞和靜息DC的LAG3 mRNA表達(dá)與啟動(dòng)子低甲基化以及RNA-seq signature呈正相關(guān)。

LAG3啟動(dòng)子高甲基化與靜息NK細(xì)胞，幼稚CD4+T細(xì)胞，M0和抗炎性M2巨噬細(xì)胞以及活化的DC的RNASeq signature 相關(guān)。這種發(fā)現(xiàn)是有趣的，因?yàn)閷?duì)于LAG3在漿細(xì)胞樣DC中的作用知之甚少。與之前的結(jié)果一致，CpG 15和16靶向的CTCF結(jié)合位點(diǎn)的高甲基化顯示出相反的模式，并與促炎或活化白細(xì)胞亞群的RNA-Seq signature 相關(guān)，而CTCF結(jié)合位點(diǎn)的低甲基化與抗炎，未分化和主要靜息免疫細(xì)胞亞群的RNA signatures 相關(guān)(圖3)。

4、外周血細(xì)胞，黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞系亞群中的LAG3甲基化

在下一步中，研究了黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞系以及包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞在內(nèi)的單個(gè)的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的LAG3甲基化。與先前的結(jié)果一致，整個(gè)腫瘤組織中LAG3 mRNA表達(dá)與淋巴細(xì)胞評(píng)分之間顯著相關(guān)以及LAG3啟動(dòng)子甲基化與淋巴細(xì)胞評(píng)分之間呈負(fù)相關(guān)(表1)，分離的PBMCs在CpG位點(diǎn)3至7和11處有明顯的LAG3低甲基化，它們都位于啟動(dòng)子區(qū)域(圖4)。黑色素瘤細(xì)胞系在LAG3啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化。該結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)分析中證明的相關(guān)性相符，顯示了由磁珠1至12靶向區(qū)域中的高甲基化與腫瘤細(xì)胞含量和純度相關(guān)。黑色素細(xì)胞中的甲基化模式類似于在黑色素瘤細(xì)胞中觀察到的模式，并且在CpG位點(diǎn)1至9中顯示出高水平的甲基化。但是，在甲基化模式中觀察到的變異性較大。與黑色素瘤細(xì)胞相比，CpG位點(diǎn)11、14和15顯示出較低的甲基化水平。CpG位點(diǎn)16僅顯示了淋巴細(xì)胞評(píng)分與LAG3甲基化之間相關(guān)性的趨勢(shì)。因此，黑素瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的甲基化之間只有少量但顯著的差異(圖4)。

5、LAG3甲基化與干擾素-γ signature的相關(guān)性

關(guān)于LAG3作為參與免疫應(yīng)答的抑制受體的功能，分析了LAG3的mRNA表達(dá)和甲基化與由IFN-γ(IFNG)和IFN-γ調(diào)節(jié)基因(STAT1，STAT2，JAK2和IRF9；表2)的相關(guān)性。如預(yù)期，LAG3 mRNA表達(dá)與INF-γ signature顯著相關(guān)。與先前的發(fā)現(xiàn)一致，啟動(dòng)子區(qū)域中的LAG3甲基化與INF-γ signature呈負(fù)相關(guān)，而與位于珠14和15靶向的基因體和CTCF結(jié)合位點(diǎn)的CpG位點(diǎn)則顯示出顯著的正相關(guān)。

6、腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性LAG3 mRNA表達(dá)依賴于藥理脫甲基和干擾素-γ刺激

對(duì)黑色素瘤中LAG3的腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性mRNA表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄組調(diào)控了解甚少。因此，研究了黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中LAG3 mRNA的表達(dá)以及次甲基化劑5-氮雜胞苷對(duì)LAG3的影響。實(shí)驗(yàn)包括四個(gè)不同的治療組：1.不治療，2. IFN-γ，3.  5-氮胞苷，4. IFN-γ和5-氮胞苷(圖5A和圖5B)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了9次，實(shí)驗(yàn)1有6次重復(fù)(1.1-1.6)和3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(2-4)使用qMSP量化了8珠靶向的啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)的啟動(dòng)子甲基化水平。

如預(yù)期，經(jīng)5-氮雜胞苷處理的細(xì)胞系中的甲基化水平顯著低于未經(jīng)5-氮雜胞苷處理的組中的甲基化水平(圖5B)。IFN-γ治療對(duì)甲基化水平?jīng)]有顯著影響。在下一步中，通過qRT-PCR定量了LAG3 mRNA水平。與的預(yù)期相反，對(duì)照組中沒有5-氮雜胞苷的單獨(dú)IFN-γ刺激導(dǎo)致LAG3 mRNA表達(dá)顯著下降(圖5A)。然而，5-氮雜胞苷處理導(dǎo)致LAG3表達(dá)顯著增加。有趣的是，除5-氮胞苷處理外，IFN-γ刺激還導(dǎo)致LAG3 mRNA表達(dá)顯著且急劇增加。

7、LAG3甲基化和mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)和分子特征的關(guān)系

根據(jù)TCGA隊(duì)列數(shù)據(jù)分析了LAG3甲基化模式和mRNA表達(dá)與臨床病理，流行病學(xué)和分子特征的可能相關(guān)性，以確定具有預(yù)后意義的參數(shù)。但并未發(fā)現(xiàn)LAG3 mRNA表達(dá)或甲基化與年齡或性別之間的顯著相關(guān)性。分析LAG3 mRNA在不同腫瘤組織部位的表達(dá)表明，與原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相比，LAG3 mRNA在區(qū)域淋巴結(jié)和皮膚轉(zhuǎn)移中的表達(dá)更高。LAG3 mRNA表達(dá)在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中最低。

這些表達(dá)上的差異也可以歸因于不同的腫瘤細(xì)胞含量。因此，LAG3甲基化狀態(tài)的差異取決于腫瘤部位。在從淋巴結(jié)獲得的組織中，被2-12個(gè)磁珠靶向的CpG位點(diǎn)的平均啟動(dòng)子甲基化最低。磁珠14-16靶向的CpG位點(diǎn)的甲基化水平，包括LAG3基因的CTCF結(jié)合位點(diǎn)，在淋巴結(jié)和皮膚轉(zhuǎn)移中最高，這可能歸因于淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的增加。作者沒有進(jìn)行進(jìn)一步的亞組分析以比較不同腫瘤部位內(nèi)臟轉(zhuǎn)移中的LAG3甲基化，因?yàn)門CGA數(shù)據(jù)中包含的單個(gè)亞組太小，無法進(jìn)行有效的亞組分析。

8、 黑色素瘤中LAG3甲基化和mRNA表達(dá)的預(yù)后價(jià)值

在TCGA隊(duì)列中測(cè)試了LAG3 mRNA表達(dá)和甲基化的預(yù)后意義。測(cè)試甲基化和mRNA表達(dá)水平并將他們作為連續(xù)變量，以避免由于引入了用于患者樣品分類的閾值而導(dǎo)致擬合過度的模型。證明LAG3 mRNA表達(dá)的增加與黑色素瘤患者的總體生存率顯著提高有關(guān)。根據(jù)該結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分析的16個(gè)磁珠中有13個(gè)磁珠靶向的CpG位點(diǎn)的高甲基化與較差的結(jié)局相關(guān)，研究的4個(gè)磁珠中，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

當(dāng)進(jìn)一步將mRNA表達(dá)和甲基化數(shù)據(jù)二分以優(yōu)化閾值，Kaplan-Meier生存曲線證實(shí)了LAG3 mRNA表達(dá)較高的患者的生存率顯著提高(圖6)。該基因啟動(dòng)子區(qū)域(珠3、4、6、8、11、12)的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)的Kaplan-Meier生存圖進(jìn)一步證實(shí)作者的發(fā)現(xiàn)，即LAG3啟動(dòng)子低甲基化與更好的生存結(jié)果相關(guān)。相反，當(dāng)表征磁珠14和15靶向的基因體中CpG位點(diǎn)和CTCF結(jié)合位點(diǎn)的甲基化時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些CpG位點(diǎn)的高甲基化與黑色素瘤患者的更好生存結(jié)果相關(guān)(圖6)。

9、免疫檢查點(diǎn)阻斷治療黑色素瘤患者LAG3甲基化與無進(jìn)展生存的關(guān)系

進(jìn)一步測(cè)試了LAG3甲基化作為ICB轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。通過將qPCR靶向的CpG位點(diǎn)8和4測(cè)量的治療前樣品中的無進(jìn)展生存期(PFS)與甲基化水平相關(guān)聯(lián)。在單變量Cox比例分析中，發(fā)現(xiàn)LAG3高甲基化腫瘤患者PFS有縮短的趨勢(shì)。當(dāng)使用優(yōu)化后的閾值進(jìn)一步將甲基化數(shù)據(jù)二分時(shí)，Kaplan-Meier生存曲線表明患有低甲基化腫瘤的黑色素瘤患者的PFS更好(圖7)。

本篇文章主要是研究黑色素瘤中LAG3 DNA甲基化與基因表達(dá)，臨床病理參數(shù)，分子和免疫相關(guān)性以及結(jié)局的關(guān)系。隨后，測(cè)試了LAG3甲基化作為黑色素瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制反應(yīng)的預(yù)后生物標(biāo)志物和預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的性能。對(duì)該基因的表觀遺傳調(diào)控的深入了解可能為開發(fā)預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物鋪平道路，以鑒定潛在受益于LAG3拮抗劑治療的患者。

編輯：鄧慧

校審：林安琪 劉郁辰