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吉凱高分文章解析系列，今天為您帶來的是2017年8月發(fā)表在Nature（IF：40.13）上的，利用CRISPR/Cas9文庫技術篩選影響T細胞殺傷效果的關鍵基因的一篇文章。
我們都知道體細胞的突變會影響腫瘤細胞對于T細胞免疫治療的敏感性。體細胞突變會影響T細胞對腫瘤細胞的殺傷，本文作者用黑色素瘤模擬腫瘤殺傷時的失活突變。作者所采用的方法是針對20000個基因的全基因組的CRISPR/CAS9文庫系統(tǒng)，在這個文庫系統(tǒng)中，包含123000條sgRNA，即每個基因設計六個靶點進行基因敲除，篩選敲了哪些基因影響效應CD8細胞殺傷能力。文章發(fā)現抗原呈遞和IFN-GAMMA是在其中起到關鍵作用的。作者比較不同細胞系和抗原，發(fā)現了APLNR基因（一個脂肪炎癥因子受體）的失活突變會導致腫瘤細胞對免疫治療很耐受。同時，本文的機制研究部分，驗證了APLNR和JAK1相互作用，調控IFN-GAMA反應。它的缺失導致細胞轉移和檢查點阻滯的免疫療法受阻。 這篇文章所用的系統(tǒng)是雙細胞crispr篩選系統(tǒng)。其中，靶細胞是常用的ESO-1黑色素瘤細胞系，T細胞轉染了特異性針對NY-ESO1抗原的TCR。上圖為系統(tǒng)示意圖。a-c顯示病人患者中B2M和TAP這兩種與抗原呈遞有關系的基因高表達的患者預后好，圖d顯示了這個雙細胞系統(tǒng)工作的原理。e是將不同的兩株靶細胞細胞系和T細胞放在一起殺傷比較，結果顯示，帶有ESO-1抗原的腫瘤細胞被殺得很多。F是將臨床已知的抗原呈遞基因敲了，結果和預期一致。 A圖描述了文庫工作的原理：針對全基因組全部基因的每個基因設計6個敲除靶點，包成慢病毒文庫。用一部分文庫慢病毒去感染腫瘤細胞系，另一部分作為對照，最終比較存活的腫瘤細胞中sgRNA的拷貝數，含有高拷貝數的細胞即代表敲除對應基因會使腫瘤細胞對免疫治療耐受。圖B、C即是通過高通量篩選找到的基因的名字，D是高排名基因的sgRNA有多少條拷貝。通過對D圖中的基因進行生信分析，作者找到抗原呈遞通路相關被顯著富集排（圖E）。 后面作者進行了分析數據，C圖的CYT是TCGA里面的腫瘤殺傷能力相關基因，結果顯示大部分是抗原呈遞和IFNγ相關的基因。D是聚類熱圖分析，也驗證了同樣的結論。 之后，本文為了驗證高通量篩選的有效性，針對單個基因，在不同的癌癥和抗原里做實驗驗證。C可以看到作者換了一個別的黑色素瘤細胞系會產生一些結果差異，但是大部分還是不變。D是換了腎癌細胞系，結果一致。 A是病人樣本中使用CTLA4或者PD1以后出現的突變，B是說這些突變的基因功能是差一些的。篩選發(fā)現JAK1通路在敲了APLNR后變化最明顯。下面圖defg是各種體外驗證。H是一個體內驗證，B16細胞敲了APLNR后對T細胞更加耐受。至此，作者得出結論：APLNR和JAK1通過相互作用調控IFN-GAMA反應，該基因的缺失導致細胞轉移和檢查點阻滯的免疫療法受阻。 |
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