1.人參皂苷Rb1減少再灌注后琥珀酸酯驅(qū)動的ROS產(chǎn)生

線粒體ROS在原代成年小鼠心肌細胞中受到I/R損傷后迅速增加，但通過人參皂苷Rb1預處理而被阻止（圖1A）。因為積累的琥珀酸酯是再灌注后線粒體ROS產(chǎn)生的驅(qū)動力，所以我們用細胞滲透性琥珀酸二甲酯處理了心肌細胞，并通過寡霉素抑制ATP合酶來模仿RET介導的ROS產(chǎn)生。由于抑制ATP合酶引起了高Δψm，琥珀酸誘導了ROS的增加，而人參皂苷Rb1的預處理降低了琥珀酸誘導的ROS釋放（圖1B）。為了證實其在體內(nèi)的作用，我們使用了線粒體靶向的ROS探針MitoB來量化遭受I/R損傷的小鼠心臟中ROS的產(chǎn)生。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1的給藥在再灌注階段早期有效地阻斷了線粒體ROS的產(chǎn)生（圖1C），并且人參皂苷Rb1減弱了DNA的氧化損傷（圖1D）。此外，我們觀察到，再灌注前人參皂苷Rb1的使用在I/R手術(shù)后的第14天顯著降低了ROS的水平，這種作用甚至在第28天仍然存在（圖1E-F）。                         

圖1 人參皂苷Rb1減少了再灌注時琥珀酸酯驅(qū)動的ROS的產(chǎn)生

A.用線粒體超氧化物歧化酶(MitoSOX Red)超氧化物指示劑檢測缺氧/復氧處理的成人原代心肌細胞的ROS生成。B.用琥珀酸二甲酯(Suc)和寡霉素(Olego)處理原代心肌細胞2h后ROS的生成。C.觀察人參皂甙Rb1對再灌注15min后心肌細胞ROS生成的抑制作用。D.缺血30min再灌注15min小鼠心臟8-羥基鳥苷(8-OHG)免疫組織化學染色。人參皂苷Rb1預處理對再灌注后第14天(E)或28天(F)心臟ROS水平的影響。

2. 人參皂苷Rb1引起的ROS減少可保護心肌細胞免受急性I/R損傷

I/R損傷線粒體功能，如引起原代心肌細胞中MPTP的打開和Δψm的改變（圖2A-B），人參皂苷Rb1預處理可防止這些改變，并且人參皂苷Rb1相應地減少了細胞死亡（圖2C）；同樣，人參皂苷Rb1在I/R損傷有效減少了心肌細胞凋亡（圖2D）。人參皂苷Rb1在缺血前和再灌注開始時均顯著減少了梗塞面積（圖2E）。但是，再灌注后15分鐘給藥時我們未觀察到這種保護作用（圖2E），這表明及時干預對心臟保護至關(guān)重要。 

圖2 人參皂苷Rb1引起的ROS減少可保護心肌細胞免受急性I/R損傷

A-C，成年原代心肌細胞用人參皂甙Rb1(10μM)處理，低氧(1%O2)1h后復氧1h(H/R)。測定線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(A)、4個獨立實驗的代表性圖像和線粒體電位定量(Δψm) (B)，以及細胞存活率(C)。D.缺血30min再灌注24h小鼠心臟典型圖像及TUNEL染色。E，心肌缺血再灌注損傷小鼠，在缺血前、再灌注開始時和再灌注15min后給予人參皂甙Rb1TTC染色的代表性照片。

3. 再灌注前人參皂苷Rb1的給藥有助于改善恢復過程中的心臟功能

再灌注期間ROS的產(chǎn)生是心臟功能受損，預后不良的原因。我們觀察到，在缺血之前人參皂苷Rb1的給藥可維持心臟功能，并防止I/R損傷后2周的小鼠線粒體腫脹（圖3A-B）。心臟基因譜分析的相應結(jié)果表明，與心肌纖維化相關(guān)的幾種生物學途徑均受到影響。這些基因集與TGF-β信號通路和ECM-受體相互作用有關(guān)，在再灌注前人參皂苷Rb1逆轉(zhuǎn)它們的上調(diào)（圖3C）。隨著心臟損傷的進展，缺血前人參皂苷Rb1的給藥可在I/R損傷后28天中保持小鼠心臟功能并減輕心臟纖維化（圖3D）。這些結(jié)果表明，再灌注前給予人參皂苷Rb1不僅減少了急性心肌細胞的損害，而且在恢復過程中也有助于改善心臟功能。

圖3 再灌注前人參皂苷Rb1的給藥有助于恢復過程中心臟功能的改善

A.I/R損傷后14d心功能測定。B.I/R損傷后14d測定心肌線粒體結(jié)構(gòu)。C.I/R損傷后14天測量心臟基因圖譜。D.小鼠心肌缺血再灌注28d后心臟立體、典型圖像及Masson's三色染色定量。 

4.蛋白質(zhì)組學揭示人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)線粒體復合體I

因為線粒體ROS引起再灌注損傷，所以我們從接受I/R損傷的小鼠心臟中純化了線粒體，以進行基于TMT的定量蛋白質(zhì)組分析。在不存在其他蛋白質(zhì)的情況下，線粒體蛋白質(zhì)中禁止素的相對強度顯著增加，表明其高純度和富集（圖4A）。有17262個肽被映射到3054個蛋白質(zhì)中（圖4B），以p值<0.05為標準，我們發(fā)現(xiàn)591個顯著變化的蛋白質(zhì)。與對照組相比，I/R組的186個蛋白表達升高，而405個蛋白表達降低（圖4B）。PCA分析表明，I/R組與對照組明顯分離，人參皂苷Rb1處理可部分逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)模式（圖4C）。

接下來，根據(jù)它們的變化趨勢，我們將這些差異蛋白分為4個簇（圖4D）。在I/R組中，簇1中的蛋白質(zhì)高度增加，但在人參皂苷Rb1處理組中明顯減少。I/R組簇2中的蛋白質(zhì)表達減少，而人參皂苷Rb1處理組中的蛋白質(zhì)表達增加；人參皂苷Rb1處理對簇3和4中的蛋白質(zhì)沒有影響，這些結(jié)果表明，簇1和2中的蛋白質(zhì)被人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)。對簇1和2的GO分析表明，這些蛋白質(zhì)的分子功能與氧化還原酶和NADH脫氫酶活性密切相關(guān)（圖4E）。有趣的是，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析表明，這些蛋白質(zhì)彼此相互作用，并與氧化磷酸化和核糖體功能有關(guān)（圖4F）。具體而言，線粒體復合體I蛋白在心肌損傷中上調(diào)，但被人參皂苷Rb1挽救到正常水平（圖4F）。表1列出了在再灌注早期人參皂苷Rb1對線粒體復合體I蛋白的調(diào)節(jié)作用，其中，通過人參皂苷Rb1處理可顯著拯救位于NADH脫氫酶（N模塊）亞單位中的蛋白質(zhì)，例如Ndufv1，Ndufv2，Ndufs1，Ndufs4，Ndufs6和Ndufa12（圖4G，表1）。綜上所述，這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1可能通過調(diào)節(jié)線粒體復合體I中的蛋白質(zhì)來保護心臟免受I/R損傷。 

圖4 蛋白質(zhì)組學揭示人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)線粒體復合體I

C57BL/6J小鼠腹腔注射人參皂苷Rb1(50mg/kg)，心肌缺血30min，再灌注15min。提取心肌組織線粒體蛋白進行蛋白質(zhì)組學分析。A.Western blot檢測從心臟組織中提取的濃縮線粒體片段的純度。B.缺血/再灌注(I/R)組和假手術(shù)組比較，蛋白質(zhì)有明顯變化。C.假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)和I/R+人參皂苷Rb1治療組(I/R+Rb1)的主成分分析(PCA)。D.根據(jù)假手術(shù)組、I/R組和I/R+Rb1組的變化趨勢對差異顯著的蛋白質(zhì)進行聚類分析。每條折疊線代表一種蛋白質(zhì)的變化趨勢。定位于簇1和簇2的蛋白質(zhì)被認為是被人參皂苷Rb1拯救或調(diào)節(jié)的。E.使用基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫對人參皂苷Rb1拯救或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)進行功能分類。利用string數(shù)據(jù)庫對人參皂苷Rb1挽救或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析。紅色和藍色表示人參皂苷Rb1拯救或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的程度。G.人參皂苷Rb1處理挽救或調(diào)節(jié)的線粒體復合體I中定位蛋白的分布示意圖。

表1 人參皂苷Rb1對再灌注早期線粒體復合體I蛋白的調(diào)節(jié)

5.人參皂苷Rb1選擇性抑制線粒體復合體I的活性，但不抑制復合體II和IV的活性

接下來，我們檢查了人參皂苷Rb1是否調(diào)節(jié)線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈功能。盡管對基礎(chǔ)OCR沒有顯著影響，但人參皂苷Rb1顯著抑制了最大呼吸，而不會影響對抗霉素A不敏感的非線粒體O₂的消耗（圖5A）。當丙酮酸和蘋果酸用作底物時，人參皂苷Rb1處理抑制了心肌細胞中復合體I依賴性O(shè)₂消耗（圖5B）；同樣，人參皂苷Rb1在分離的線粒體中抑制線粒體復合體I的活性（圖5C）。不同的是，魚藤酮不可逆地抑制線粒體復合體I活性，而洗脫掉人參皂苷Rb1之后，線粒體復合體I的活性可以恢復（圖5D）。該結(jié)果表明人參皂苷Rb1的抑制作用是可逆的。當我們將琥珀酸酯用作復合體II激活的底物時，人參皂苷Rb1不會改變完整心肌細胞中的O₂消耗，并且它也不能抑制分離的線粒體中的線粒體復合體II活性（圖5E）；同樣，人參皂苷Rb1對線粒體復合體IV依賴的呼吸作用和復合體IV活性也沒有影響（圖5F）。綜上所述，這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1以可逆的方式特異性抑制線粒體復合體I的活性。

圖5 人參皂苷Rb1選擇性抑制線粒體復合體I的活性，但不抑制復合體II和IV的活性A.H9c2細胞在人參皂苷Rb1(10μM)、FCCP(2.5μM)、丙酮酸(PYR，10mM)和抗霉素A(AA，1μM)存在下的耗氧率(OCR，%基線)。B.用洋地黃(3μg/mL)滲透H9c2細胞，然后用ADP(1 MM)、丙酮酸(5 MM)、蘋果酸(5 MM)和Rb1(10μM)刺激H9c2細胞。C.人參皂苷Rb1(10μM)或魚藤酮(1μM)對H9c2細胞線粒體復合體I活性的影響。D.OCR檢測ADP(1 MM)、谷氨酸(5 MM)+蘋果酸(5 MM)和琥珀酸(5 MM)對H9c2細胞通透性的影響。在此，H9c2細胞在OCR測量前用人參皂苷Rb1(10μM)或魚藤酮(1μM)預處理1h。E.在琥珀酸(5 MM)、魚藤酮(0.5μM)和人參皂苷Rb1(10μM)存在下，通透性H9c2細胞的E、OCR(%基線)。F.注射FCCP(2.5μM)、TMPO(0.4mM)+抗壞血酸(0.4 mM)、人參皂苷Rb1(10μM)和疊氮(5 MM)的H9c2細胞的OCR(%基線)。

6. 人參皂苷Rb1可逆地抑制線粒體復合體I的NADH脫氫酶

復合體I的NADH脫氫酶是產(chǎn)生ROS的候選位點。由于蛋白質(zhì)組學結(jié)果表明，屬于NADH脫氫酶亞基的差異蛋白的水平隨I/R損傷而改變，因此我們檢查了這些蛋白的基因和蛋白表達。I/R處理上調(diào)了心肌細胞中Ndufv1，Ndufv2，Ndufs1，Ndufs4和Ndufa12的mRNA表達，但人參皂苷Rb1預處理降低了這些增加的基因表達（圖6A）。在I/R條件下，NADH脫氫酶這些亞基的基因敲低減少了ROS的產(chǎn)生并保護了細胞的活力（圖6B-C）。人參皂苷Rb1在基礎(chǔ)和I/R條件下均降低了心肌細胞線粒體復合體I的NADH脫氫酶活性（圖6D-E）。線粒體復合體I抑制劑魚藤酮不能抑制NADH脫氫酶，因為它與泛醌結(jié)合，而不是NADH脫氫酶。人參皂苷Rb1的洗脫恢復了NADH脫氫酶的活性，表明人參皂苷Rb1對復合體I的抑制作用是可逆的（圖6F）。為了確認人參皂苷Rb1調(diào)控NADH脫氫酶的特殊作用，我們將編碼釀酒酵母內(nèi)部NADH脫氫酶的基因轉(zhuǎn)染到了H9c2細胞中。Ndi1是單個多肽，可作為哺乳動物線粒體呼吸鏈中復合體I的替代分子。人參皂苷Rb1無法降低Ndi1表達細胞中的OCR（圖6G）；同樣，表達Ndi1的細胞對人參皂苷Rb1在I/R刺激下對ROS產(chǎn)生的抑制作用具有抗性（圖6H），而Ndi1的表達加重了RET介導的ROS產(chǎn)生，并逆轉(zhuǎn)了人參皂苷Rb1的抑制作用（圖6I）。這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1的心臟保護作用可能是由于其抑制了線粒體復合體I中的NADH脫氫酶活性。 

圖6 人參皂苷Rb1可逆地抑制線粒體復合體I的NADH脫氫酶

A.缺氧再灌注心肌細胞Ndufv1、Ndufv2、Ndufs1、Ndufs4、Ndufs6和Ndufa12的mRNA表達。轉(zhuǎn)染Ndufv1、Ndufv2、Ndufs1、Ndufs4、Ndufs6和Ndufa12 siRNA的H9c2細胞的B-C、ROS水平(B)和細胞存活率(C)。D.人參皂苷Rb1或魚藤酮對成人原代心肌細胞NADH脫氫酶活性的影響。E.成年原代心肌細胞缺氧(1h)再灌注15min后NADH脫氫酶活性。F.成年原代心肌細胞用人參皂苷Rb1(10μM)預處理1h，然后將人參皂苷Rb1留在原代心肌細胞上進行進一步測定，或?qū)⑷藚⒃碥誖b1洗掉，繼續(xù)培養(yǎng)1h，測定NADH脫氫酶活性。G.Ndi1蛋白在轉(zhuǎn)染Ndi1質(zhì)粒的H9c2細胞中的表達。在人參皂苷Rb1(10μM)、FCCP(2.5μM)、丙酮酸(PYR，10 mM)和抗霉素A(AA，1μM)存在下，Ndi1表達細胞的耗氧率(OCR，%基線)。H.Ndi1蛋白表達。缺氧/再灌注損傷時表達Ndi1的細胞內(nèi)ROS水平的變化。I. Ndi1蛋白表達。琥珀酸二甲酯和寡霉素作用于表達Ndi1細胞2h后產(chǎn)生的ROS。

7.人參皂苷Rb1控制線粒體復合體I的活性/去活性轉(zhuǎn)變，以調(diào)節(jié)NADH脫氫酶活性

在I/R損傷中，線粒體復合體I的活性/失活轉(zhuǎn)變與ROS的產(chǎn)生高度相關(guān)，呼吸系統(tǒng)復合體I的失活形式被認為是Na⁺/H⁺反向轉(zhuǎn)運蛋白。因此，我們在H9c2細胞中測量了線粒體基質(zhì)的pH（圖7A）。在缺血狀態(tài)下，線粒體內(nèi)pH較低，但對再灌注響應升高（圖7A）。人參皂苷Rb1處理在再灌注后可使線粒體內(nèi)pH保持在較低水平，這表明人參皂苷Rb1使線粒體復合體I保持失活狀態(tài)（圖7A）。響應缺血或溫度處理而發(fā)生的構(gòu)象變化導致線粒體亞基ND3內(nèi)關(guān)鍵Cys-39的暴露，可以用巰基特異性試劑標記線粒體復合體I的失活（圖7B）；此外，人參皂苷Rb1在再灌注中保護了ND3在小鼠心臟中的暴露，進一步證實了人參皂苷Rb1對體內(nèi)線粒體復合體I狀態(tài)的影響（圖7C）。為了揭示潛在的機制，我們進行了分子對接，以測試人參皂苷Rb1與復合體I中參與活性/失活轉(zhuǎn)變的亞基（ND3，ND1和Ndufa9）之間的潛在相互作用，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1與Cys-39，Tyr-37和Asp-42的ND3氨基酸殘基相互作用（圖7D）。為了確認人參皂苷Rb1是否直接靶向ND3，我們進行了表面等離子體共振技術(shù)，結(jié)果表明人參皂苷Rb1對ND3表現(xiàn)出很強的結(jié)合親和力（圖7E）。這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1可能通過與復合體I中的ND3亞基結(jié)合而使酶陷入失活構(gòu)象。失活狀態(tài)的特征是與活性構(gòu)象相比，NADH脫氫酶活性較低。通過限制處于失活狀態(tài)的線粒體復合體I，人參皂苷Rb1處理在再灌注或再激活階段具有較低的NADH脫氫酶活性（圖7F）。 

圖7 人參皂苷Rb1控制線粒體復合體I的活性/去活性轉(zhuǎn)變，以調(diào)節(jié)NADH脫氫酶活性

A.有絲分裂細胞線粒體定位的代表性圖像。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MITO-Sypher的H9c2細胞。B.線粒體復合體的BODIPY-TMR標記示意圖。C.I/R損傷時小鼠心臟線粒體蛋白的BODIPY-TMR信號(左)。D. AutoDock預測人參皂苷Rb1與參與活性/失活轉(zhuǎn)換的線粒體復合物I亞基(ND3、ND1和NDUfa9)之間的結(jié)合模式。E.人參皂苷Rb1與人重組ND3蛋白結(jié)合的SPR分析。F.人參皂苷Rb1(10μM)處理H9c2細胞，缺氧1h，復氧和不復氧15min下的線粒體復合物I活性。

再灌注后，琥珀酸脫氫酶激活會由于RET而驅(qū)動復合體I上ROS生成，而通過抑制復合體I可以抑制以這種方式生成ROS。魚藤酮通過調(diào)節(jié)泛醌以減弱電子通量來抑制復合體I活性；另外，線粒體復合體I在特定部位的S-亞硝化可限制再灌注時ROS的產(chǎn)生。在本篇文章中，我們確定了線粒體復合體I中的NADH脫氫酶亞基蛋白是人參皂苷Rb1調(diào)控的潛在靶標。由于線粒體ROS的產(chǎn)生是再灌注損傷的最初原因，人參皂苷Rb1抑制NADH脫氫酶的活性，從而阻止了ROS的產(chǎn)生，表明其在心臟保護中的特殊作用。

在處理急性心肌缺血中，及時進行再灌注對于挽救心肌至關(guān)重要；但是，這種干預受到了再灌注損傷的挑戰(zhàn)。據(jù)報道，致命的心肌再灌注損傷可能占最終梗死面積的50％，盡管涉及許多病理生理因素，但線粒體ROS的產(chǎn)生已成為導致I/R引起組織損傷的一系列事件的最初原因。人參皂苷Rb1已被證明可以保護心臟免受I/R損傷，我們進一步證實，這種心臟保護作用很大程度上取決于再灌注后對ROS的抑制作用。在缺血性心臟中，在再灌注的早期會迅速產(chǎn)生過量的ROS，而在I/R損傷之前給予人參皂苷Rb1可以減少ROS的產(chǎn)生并防止心臟中的DNA氧化損傷。由于缺血的預防性治療在臨床上不可行，因此我們在再灌注開始時研究了人參皂苷Rb1的治療方法并確認了其保護作用。但是，再灌注后15分鐘給藥無法保護心臟。重要的是，再灌注前人參皂苷Rb1的治療可提供長期的心臟保護作用。因為在再灌注的前10–20分鐘內(nèi)過量的ROS產(chǎn)生對于急性和長期心臟損害都是至關(guān)重要的，所以我們認為在再灌注早期抑制ROS產(chǎn)生是人參皂苷Rb1主要的保護機制。

線粒體ROS通常被認為是ETC損壞引起的，因為增加的電子泄漏會在復合體I和III上產(chǎn)生超氧化物。抑制復合體I會阻止電子沿著ETC流動，從而導致ROS的產(chǎn)生增加。當電子無法轉(zhuǎn)移到CoQ時，高度還原的FMN驅(qū)動電子泄漏以生成ROS；然而，最近的一項研究表明，線粒體復合體I的抑制在再灌注的早期階段有助于減弱RET介導的ROS爆發(fā)。再灌注后，線粒體復合體II的琥珀酸氧化生成大量電子提供燃料，從而導致最大Δψm并大大降低了CoQ池。然后，高膜電位迫使電子從CoQ池向復合體I中的FMN流動，從而產(chǎn)生ROS。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)線粒體ETC功能。研究者們已經(jīng)使用了許多蛋白質(zhì)組學和代謝組學等組學技術(shù)來確定缺血性心臟病的潛在治療靶點，在本研究中，蛋白質(zhì)組學結(jié)果表明人參皂苷Rb1可能通過調(diào)節(jié)復合體I活性來保護心臟免受I/R損傷?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明人參皂苷Rb1通過調(diào)節(jié)復合體I活性阻止了RET介導的ROS產(chǎn)生。

復合體I是NADH：泛醌氧化還原酶，它利用NADH氧化和泛醌還原作用生成ATP。哺乳動物復合體I包含三個結(jié)構(gòu)模塊：N，Q和P。其中，N-模塊（脫氫酶模塊）包含Ndufv1，Ndufv2，Ndufs1，Ndufs4，Ndufs6等。通過比較蛋白質(zhì)組學分析，我們發(fā)現(xiàn)當心臟受到I/R損傷時，線粒體復合體I中的NADH脫氫酶亞基為人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)的潛在效應蛋白。與已發(fā)表的研究表明這些亞基的化學修飾或遺傳損失可以保護心臟免受缺血性應激的影響一致，我們證明了這些亞基的敲除減少了ROS的產(chǎn)生并保護了心肌細胞。為了進一步證實人參皂苷Rb1在抑制NADH脫氫酶中的特殊作用，我們在心肌細胞中過表達Ndi1，其中，Ndi1是編碼釀酒酵母線粒體對魚藤酮不敏感的內(nèi)部NADH-醌氧化還原酶的基因，可以將其轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞的線粒體中，作為復合體I的替代分子，將電子從NADH轉(zhuǎn)移到泛醌庫中。人參皂苷Rb1不能抑制表達Ndi1的細胞中的復合體I活性和減少ROS的產(chǎn)生，支持了我們的推測，即它通過抑制NADH脫氫酶防止了再灌注時ROS的爆發(fā)。我們的工作進一步表明，NADH脫氫酶是一種潛在的效應子，可以通過調(diào)節(jié)其來防止RET驅(qū)動的ROS的產(chǎn)生。

在長時間的局部缺血中，由于氧氣有限，復合體I轉(zhuǎn)變?yōu)槭Щ顮顟B(tài)。與活性形式相比，復合體I的失活構(gòu)象表現(xiàn)出較低的催化活性，失去了催化RET的能力。再灌注后，復合體I迅速重新活化以進行電子轉(zhuǎn)移，從而導致過多的ROS生成。從理論上講，以失活形式暫時鎖定復合體I可作為一種保護機制，以限制ROS的產(chǎn)生。為支持該理論，有人提出利用二甲雙胍使復合體I處于失活狀態(tài)來保護心臟免遭缺血性損傷。位于ND3亞基親水環(huán)中的Cys-39的暴露是復合體I失活形式的分子特征。Cys-39的可逆翻譯后修飾是一種治療性干預措施，用于以失活形式捕獲復合體I。在本研究中，人參皂苷Rb1在再灌注的早期階段持續(xù)暴露了被硫醇特異性試劑標記的ND3亞基，表明其將復合體I鎖定在低活性狀態(tài)的潛在能力。進一步的分子對接分析表明，人參皂苷Rb1通過在三個氨基酸殘基（包括Cys-39）處的氫鍵與ND3的親水環(huán)相互作用。SPR分析進一步表明人參皂苷Rb1可以高親和力結(jié)合ND3亞基。這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1可能通過結(jié)合ND3亞基而以其失活構(gòu)象捕獲線粒體復合體I，但是，需要進一步研究來闡明人參皂苷Rb1作用于線粒體復合體I的具體分子機制。不過，我們的結(jié)果表明人參皂苷Rb1作用于NADH脫氫酶活性的潛在機制可能源于其對活性/去活性的調(diào)控。

哺乳動物成年心肌細胞是終末分化的，因此，成年心臟在心肌細胞喪失后不能再生，這主要是由于出生后心肌細胞周期停滯所致。因此，在人參皂甙Rb1治療的小鼠腦缺血后，我們觀察到的梗死面積縮小應該是其對再灌注損傷的最初保護作用的持久結(jié)果。心肌梗死后，重構(gòu)過程最初作為一種代償調(diào)節(jié)對心臟起到保護作用；然而，由于心肌僵硬，不受控制的纖維化反應會損害心臟功能。由于梗死心臟是纖維化的，我們檢測了人參皂苷Rb1在缺血后的長期效應，并證實了它對心肌纖維化的抑制作用。這表明，限制再灌注損傷對于恢復期的功能改善很重要，但需要注意的是，恢復期觀察到的心功能改善是多方面調(diào)節(jié)的最終結(jié)果。考慮線粒體功能的全面研究對于全面評估潛在的影響是必要的，因此，我們不能肯定地說，對抗再灌注損傷是觀察到的心功能改善的唯一原因。雖然缺血只提供了一個狹窄的時間窗口來減少心臟損害，但我們的工作強調(diào)了及時的治療干預對于改善預后至關(guān)重要。

總之，人參皂苷Rb1通過降低NADH脫氫酶活性并將線粒體復合體I鎖定在失活狀態(tài)，從而適度和可逆地抑制線粒體復合體I，有助于減輕心肌再灌注損傷。這些發(fā)現(xiàn)不僅為人參皂苷Rb1保護心臟免受缺血性損傷的機理提供了新穎的見解，而且還表明，調(diào)節(jié)復合體I中的NADH脫氫酶活性可能是限制再灌注誘導的線粒體ROS產(chǎn)生的潛在干預措施。