Cellular Biochemistry(IF：3.448)雜志上的一篇文章，“Identification of downregulated circRNAs from tissue and plasma of patients with gastric cancer and construction of a circRNA‐miRNA‐mRNA network”，作者利用多種公共數(shù)據(jù)庫(kù)和在線分析網(wǎng)站識(shí)別胃癌患者組織和血漿中下調(diào)的circRNA并構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。

一. 研究背景

對(duì)癌組織中circRNA的研究一直很火熱，也有很多研究發(fā)現(xiàn)circRNA對(duì)胃癌(Gastric cancer，GC)的發(fā)展起到調(diào)控作用。作者想要利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘在GC中以及GC患者血漿中差異表達(dá)的circRNAs，通過(guò)建立胃癌中的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)探索胃癌的發(fā)生機(jī)制，尋找新的胃癌標(biāo)志分子。作者同時(shí)選了血漿樣本數(shù)據(jù)也是為了使結(jié)果服務(wù)于臨床，便于利用GC患者血漿對(duì)一些情況做出預(yù)測(cè)。

二. 研究思路

三. 結(jié)果解析

1. 識(shí)別DECs即差異表達(dá)的circRNAs

圖1. 篩選差異表達(dá)的circRNAs

GSE89143數(shù)據(jù)集樣本為3個(gè)GC組織 vs 3個(gè)非癌組織的circRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)；GSE93541是3個(gè)GC患者plasma樣本 vs 3個(gè)正常人plasma樣本的circRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)。使用GEO2R網(wǎng)頁(yè)工具分析，篩選DECs的標(biāo)準(zhǔn)是：|log2FC|>2 ，adjp<0.05。

• A：用Venn圖取在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中共同的表達(dá)上調(diào)的DECs，數(shù)量為0。

• B：用Venn圖取在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中共同的表達(dá)下調(diào)的DECs，數(shù)量為3個(gè)。三個(gè)DECs的名稱和表達(dá)差異分析如表1所示。

表1. 三個(gè)表達(dá)下調(diào)的DECs在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的表達(dá)差異分析

2. 在細(xì)胞系中驗(yàn)證3個(gè)DECs的差異表達(dá)

圖2. 在細(xì)胞系中驗(yàn)證3個(gè)DECs的表達(dá)量

• GSE-1是人胃上皮細(xì)胞系，MGC-08是胃癌細(xì)胞系。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三個(gè)DECs的表達(dá)量，結(jié)果顯示在胃癌細(xì)胞系中三者表達(dá)量都顯著下調(diào)。

3. 預(yù)測(cè)靶miRNAs和靶mRNA

作者使用CircInteractome網(wǎng)站預(yù)測(cè)3個(gè)DECs的靶miRNA，一共有90靶miRNA被發(fā)現(xiàn)。為了進(jìn)一步減少數(shù)量，作者指定篩選標(biāo)準(zhǔn)為：miRNA在GC組織中高表達(dá)且對(duì)GC病人的預(yù)后存在負(fù)效應(yīng)。最終符合標(biāo)準(zhǔn)的miRNA有6個(gè)。對(duì)于mRNA的篩選，作者使用TargetScan網(wǎng)站和miRNet網(wǎng)站預(yù)測(cè)了6個(gè)靶miRNA的靶mRNA，取到共同的519個(gè)靶mRNA代表的基因。

圖3. 6個(gè)靶miRNA在TCGA-STAD數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況

• 圖3：用starBase網(wǎng)站分析的hsa‐miR‐323a‐3p，hsa‐miR‐331‐5p，hsamiR‐377，hsa‐miR‐485‐3p，hsa‐miR‐889和hsa‐miR‐370這6個(gè)靶miRNA在TCGA-STAD中的表達(dá)情況。紅色是胃瘤組織，紫色是正常組織。

圖4. GC患者中針對(duì)6個(gè)靶miRNA的生存分析結(jié)果

• 圖4：作者用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析的6個(gè)靶miRNA對(duì)GC患者總生存時(shí)間OS的生存分析結(jié)果。可以看到這6個(gè)靶miRNA的高表達(dá)(紅色)預(yù)示著GC患者更差的預(yù)后水平。

4. 對(duì)靶基因進(jìn)行GO和KEGG通路分析

圖5. 靶基因的GO分析結(jié)果

• 圖5：作者對(duì)前文取到的靶基因用DAVID網(wǎng)站進(jìn)行GO(Gene ontology)分析,綠色的BP代表生物學(xué)事件，紅色的CC代表細(xì)胞成分，藍(lán)色的MP代表分子功能。靶基因一共在125個(gè)GO term中顯著富集(p<0.05),這里展示了三個(gè)GO分類中靶基因富集最多的前10個(gè)GO term。

圖6. 靶基因的KEGG通路分析結(jié)果

• 圖6：作者同樣在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG通路分析。靶基因在30條通路中顯著富集(p<0.05)。這里展示了靶基因富集最多的前10條通路。

5. 構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)并識(shí)別核心基因

圖7. circRNA‐miRNA‐hub gene網(wǎng)絡(luò)

• A：作者根據(jù)3個(gè)DECs，6個(gè)靶miRNA和519個(gè)靶基因構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)并用cytoscape可視化。

• B：作者使用cytoHubba插件計(jì)算ceRNA網(wǎng)絡(luò)的參數(shù)并識(shí)別出的前100個(gè)核心靶基因。提取后可視化了這100個(gè)基因代表的蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)。

小結(jié)：由于ceRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)中三種分子的關(guān)系是circRNAs的低表達(dá)伴隨著靶miRNA的高表達(dá)和靶mRNA的低表達(dá)，或circRNAs的高表達(dá)伴隨著靶miRNA的低表達(dá)和靶mRNA的高表達(dá)。又因?yàn)楸疚牡娜齻€(gè)DECs在GC組織中是低表達(dá)的，6個(gè)靶miRNA在TCGA-STAD中驗(yàn)證是低表達(dá)的，所以作者下一步想要在TCGA-STAD中尋找100個(gè)核心基因中在GC組織中低表達(dá)的基因繼續(xù)分析。

圖8. 8個(gè)核心基因在TCGA-STAD數(shù)據(jù)集中的mRNA表達(dá)情況

• 圖8：8個(gè)核心基因(CDKN1A，MAP2K2，GADD45A，KLF2，NR3C1，PJA2，G6PC和PPP1CB)在TCGA-STAD樣本中的mRNA表達(dá)量顯著降低。紅色代表GC組織，紫色代表正常組織。

• 圖7. C：由3個(gè)DECs，6個(gè)靶miRNA和8個(gè)核心基因構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

6. 評(píng)估核心基因的預(yù)后價(jià)值

圖9. GC患者中針對(duì)8個(gè)核心基因的生存分析結(jié)果

• 圖9：作者用用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析了8個(gè)核心基因(CDKN1A，MAP2K2，GADD45A，KLF2，NR3C1，PJA2，G6PC和PPP1CB)的mRNA表達(dá)量對(duì)GC病人預(yù)后的影響。圖中黑色表示基因表達(dá)量低組，紅色表示基因表達(dá)量高組?？梢钥吹?個(gè)核心基因的低表達(dá)預(yù)示著GC病人更差的預(yù)后狀況。