胃癌（GC）是一種致命的疾病，在眾多病因中，幽門螺桿菌（H. pylori）感染是最強的治病因素。然而，幽門螺桿菌相關GC的潛在遺傳和分子機制需要進一步闡明。我們研究了幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間競爭性內源RNA（ceRNA）網絡之間的差異。

    從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了32個癌旁，18個幽門螺桿菌(+)和141個幽門螺桿菌(-)樣本的長鏈非編碼RNA（lncRNA），microRNA (miRNA)和信使RNA(mRNA)數(shù)據(jù)。構建了幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網絡后，使用Panther和Kobas數(shù)據(jù)庫分析了基因本體論（GO）和KEGG Pathway。最后用生存分析找到關鍵基因。在幽門螺桿菌(+)GC中我們發(fā)現(xiàn)了一共有1,419個lncRNAs、82個miRNAs、和 2,501個mRNAs是表達差異的。在幽門螺桿菌(-)GC中有2,225個lncRNAs、130個miRNAs和3,146個mRNAs有差異。

    此外，在幽門螺桿菌(+)GC中富集到三個獨特的通路（細胞因子-細胞因子受體相互作用，HIF-1信號傳導途徑和Wnt信號傳導途徑），根據(jù)總體生存分析，有3個lncRNA (AP002478.1,LINC00111和LINC00313) 和2個mRNAs (MYB和COL1A1)可以作為幽門螺桿菌(+)GC患者的預后生物標志物。結論，我們的研究已經確定了幽門螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC之間ceRNA調控網絡的差異，可以為將來的研究提供候選信息。

    胃癌（GC）是世界上最常見的癌癥之一，也是癌癥死亡第二大常見原因。GC患者因為疾病的發(fā)現(xiàn)晚，導致五年生存率很低。在幾種與腫瘤相關的因素中，國際癌癥研究機構將幽門螺桿菌的感染歸類為Ⅰ型致癌物，幽門螺桿菌是一種革蘭氏陰性菌，世界上一半的人口在童年時期感染了幽門螺旋桿菌。幽門螺桿菌感染改變了宿主細胞中的基因表達。持續(xù)的幽門螺桿菌感染可能導致炎癥級聯(lián)，然后引發(fā)一系列胃粘膜轉化：發(fā)生非萎縮性胃炎，然后變成多灶性萎縮性胃炎，腸上皮化生，發(fā)育不良；最后，一些被感染的病人會患上胃癌。找出GC中幽門螺桿菌致病因素如何改變細胞內信號通路，是非常重要的。只有2％的人類轉錄組是蛋白質編碼RNA，另外98％是非編碼RNA。然而，最近幾年研究人員注意到，非編碼RNA可實現(xiàn)多種生物學功能。在非編碼RNA中，長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200bp的轉錄本，不能翻譯蛋白質。lncRNA保守性差，通過順式（cis）或反式（trans）作用機制，對基因表達通路實現(xiàn)多級監(jiān)管，例如轉錄，表觀遺傳學和翻譯。

   人類疾病，特別是增殖性疾病，許多l(xiāng)ncRNA都出現(xiàn)表達模式的改變，表明lncRNAs在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面很重要。另一種小的非編碼RNAs稱為microRNAs (miRNAs),通常是22個核苷酸，是進化上保守的單鏈RNA分子。他們通過與mRNA的3’UTR配對來負調控蛋白質編碼基因的表達。在腫瘤疾病中，異常表達的miRNA在細胞增殖，遷移和侵襲中扮演重要角色。

   根據(jù)最近發(fā)現(xiàn)的競爭性內源性RNA（ceRNA）分子機制假說，mRNA和lncRNA共享一個或多個miRNA反應元件（MREs），并可作為天然miRNA海綿，這導致細胞內miRNA功能下調?，F(xiàn)在已知lncRNA-miRNA-mRNA網絡主要參與啟動、進展、入侵、和癌癥的轉移。ceRNA網絡的不平衡可能導致疾病發(fā)病機制。一些與幽門螺桿菌GC相關的非編碼RNA已經被報道了。據(jù)報道，lncRNA AF147447對幽門螺桿菌相關GC有抑制作用。Serum H19, LINC00152, 和Lnc-SGK1可作為幽門螺桿菌GC診斷的潛在生物標志物。

   在幽門螺桿菌(+)GC血清中，miR-146,miR-375和Let-7被下調，但miR-19和miR-21是上調的，用于幽門螺桿菌的清除。據(jù)報道，在幽門螺桿菌相關的GC病因學中MiR-124可以通過抑制DNA損傷起到保護作用。幽門螺桿菌(+)GC中miR128/miR148a的下調導致MMPs/E-鈣粘蛋白（E-cadherin)通路的激活并誘導GC細胞的遷移和侵襲。幽門螺桿菌感染通過增加miR-100的水平可能引起胃上皮屏障功能障礙。在幽門螺桿菌感染中，miR-195和 miR-488在控制IL-6活性上似乎扮演重要角色。來自幽門螺桿菌的CagA下調miR-320a和miR-4496然后促進GC-起始細胞特性。然而，幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間的復雜RNA干擾差異尚未得到充分研究。這凸顯了研究ceRNA網絡占據(jù)幽門螺桿菌相關GC致癌的重要性。

  在這里我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中收集了GC三種RNA的表達數(shù)據(jù)及其臨床數(shù)據(jù)。因為人們普遍認為GC是一種異質性癌癥，幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC可能在幾個方面存在重大差異：臨床、病理、分子和細胞異質性。這是第一項針對幽門螺桿菌相關GC ceRNA網絡的研究。分析差異表達基因后，我們比較了幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間ceRNA網絡，相關的富集分析結果和與總生存時間相關的關鍵基因。最后，我們發(fā)現(xiàn)了一些RNA與幽門螺桿菌(+)GC密切相關。所有這些結果為更好的理解幽門螺桿菌(+)ceRNA相關發(fā)病機制提供了可能。

   從GDC Data Portal（https://portal.gdc.）獲得胃腺癌和癌旁組織的原始RNA和miRNA測序數(shù)據(jù)。使用Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://www.），我們重新注釋RNA探針并獲得mRNA和lncRNA表達譜。這些GC樣本的相應臨床數(shù)據(jù)，含有幽門螺桿菌感染信息，也是從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的。然后我們手動將每個樣本分為兩組：幽門螺桿菌(+)組和幽門螺桿菌(-)組。最后，我們獲得了幽門螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC的lncRNA，miRNA和mRNA的表達譜。

    使用R軟件和edgeR Bioconductor包將RNA表達數(shù)據(jù)做標準化。我們在幽門螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC組織與相鄰的非癌組織中找到了lncRNAs（DElncRNA），miRNAs（DEmiRNA）和mRNAs（DEmRNA）的差異表達，3種RNA的篩選標準(1)差異倍數(shù)（log2 FC）> 1.5; (2)錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05。使用gplots>

? 圖1 幽門螺桿菌(+)/(-)GC中差異表達RNA的聚類圖。

   行代表RNA，而列代表幽門螺桿菌(+)/(-)GC樣品，log2FC > 1.5且FDR <>

（a-c）幽門螺桿菌(+)GC中差異表達的lncRNA，miRNA和mRNA;

（d-f）幽門螺桿菌(-)GC中差異表達的lncRNA，miRNA和mRNA。

? 圖2 火山圖用log2FC > 1.5 和 FDR < 0.05="">

（a-c）幽門螺桿菌(+)GC中差異表達的lncRNA、miRNA和mRNA;

（d-f）幽門螺桿菌(-)GC中差異表達的lncRNA、miRNA和mRNA。

    首先我們用starBase v2.0（http://starbase.）將DEmiRNA的名稱轉化為人類成熟miRNA名稱。在該研究中，使用miRcode database (http://www.)數(shù)據(jù)庫整合lncRNA-miRNA相互作用對。然后，DEmiRNA靶基因是使用三個數(shù)據(jù)庫miRDB、miTarBase、和TargetScan預測到的，存在于所有三個數(shù)據(jù)庫中的基因被認為是這些DEmiRNA的靶基因。將預測到的靶基因與TCGA GC樣品中差異的基因進行比較，只有重疊的基因和他們的相互作用對，才會被用于進一步分析。

通過Cytoscape軟件根據(jù)lncRNA-miRNA對和miRNA-mRNA對，構建幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC的ceRNA網絡。

? 圖3，幽門螺桿菌(+)GC的ceRNA網絡，紅色代表上調，綠色代表下調。

網絡中的LncRNA，miRNA和mRNA分別表示為菱形，矩形和圓形

條形圖顯示了在整個網絡中具有最高交互數(shù)的關鍵基因。

? 圖4，幽門螺桿菌(-)GC的ceRNA網絡。紅色代表上調，綠色代表下調

網絡中的LncRNA，miRNA和mRNA分別表示為菱形，矩形和圓形

條形圖顯示了在整個網絡中擁有最高交互數(shù)的關鍵基因

    為了對比幽門螺桿菌(-)ceRNA網絡與幽門螺桿菌(+)網絡中差異mRNA的不同生物學過程的注釋，使用基因本體論（GO）進行生物過程富集分析。KOBAS 3.0在線數(shù)據(jù)庫（http://kobas.cbi。pku.edu.cn）用于進行基因和基因組的KEGG通路富集分析，然后找到幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC潛在途徑。GO和KEGG顯著的標志是FDR＜0.05. 最后，我們比較了幽門螺桿菌(+)GC與幽門螺桿菌(-)GC的富集結果，并使用ggplot2和GOplot R包顯示結果。

? 圖5，幽門螺桿菌(+)GC的ceRNA網絡的GO生物過程和KEGG分析

(a) 特有的KEGG結果分析; 

(b) 幽門螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC之間KEGG分析的共有結果。

hsa04933：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路。

hsa05206：癌癥中的微小RNA。

hsa04115：p53信號通路。

hsa04151：PI3K-Akt信號通路。

hsa04015：Rap1信號通路。

hsa04014：Ras信號通路;

(c) GO生物過程分析的獨特結果;

(b) 幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間共同的GO分析結果（biological proces）

? 圖6，幽門螺桿菌(-)GC的ceRNA網絡的GO（biological proces）和KEGG分析結果

（a）特有的KEGG結果

（b）幽門螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC之間共同的KEGG分析結果。

hsa04933：糖尿病患者的AGE-RAGE信號通路并發(fā)癥。

hsa05206：癌癥中的microRNAs。

hsa04115：p53信號通路。

hsa04151：PI3K-Akt信號通路。

hsa04015：Rap1信號通路。

hsa04014：Ras信號通路;

（c）GO生物過程分析的特有結果;

（d）幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間共同的GO結果（biologicalProcess）

     在測試了ceRNA網絡中的所有RNA后，獲得了幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)患者的生存曲線，如圖7所示。對于幽門螺旋桿菌(+)患者，三種lncRNA：AP002478.1，LINC00111和LINC00313，以及兩種mRNA：MYB和COL1A1是與存活時間相關的RNA（p值<>

（b）LINC00313可能是COL1A1的ceRNA，它們都與hsa-miR-143相互作用。此外，所有五個生存結果都是幽門螺桿菌(+)GC特有的。

? 圖７，幽門螺桿菌(+)GC的ceRNA網絡中RNA的總體存活分析

    作為I型致癌物，幽門螺旋桿菌與各種胃病相關。發(fā)展中國家成年人幽門螺桿菌的流行率高于發(fā)達國家。感染幽門螺桿菌的大多數(shù)人患有無癥狀性胃炎，幽門螺桿菌(+)患者中有10-20％可能出現(xiàn)消化性潰瘍，這些感染者中有1％有患胃腺癌的風險。雖然已經對幽門螺桿菌相關癌變進行了大量研究，但幽門螺桿菌誘導的胃腫瘤發(fā)病機制尚不明確。因此，為了早期診斷和找到更好的治療靶點尋找獨特的標記物在征服幽門螺桿菌(+)GC中起重要作用。我們的整個工作流程如圖8所示。在我們的研究中，在幽門螺桿菌(+)GC中共有1,419個lncRNA，80個miRNA和2,501個mRNA具有差異；在幽門螺桿菌(-)GC中有2,225個lncRNA，130個miRNA和3,146個mRNA是差異的。

? 圖８，用于評估幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)RNA表達數(shù)據(jù)的一般工作流程。