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【摘要】 綜述了我國菲牛蛭的地理分布、野生資源情況、生態(tài)習性和采收季節(jié)、化學成分、生物活性成分、藥理學作用、分離純化以及菲水蛭素基因的克隆和序列測定。認為菲牛蛭可作為一種新的藥用資源加以研究。 【關鍵詞】 菲牛蛭 化學成分 藥理學作用 菲牛蛭Poecilobdella manillensis，俗名金邊螞蟥，別名為馬尼拉醫(yī)蛭，隸屬于環(huán)節(jié)動物門Annelida，蛭綱Hirudinea，無吻蛭目Arhynchobdellida Blanchard，醫(yī)蛭科Hirudindae Whitman，牛蛭屬Poecilobdella Blanchard。牛蛭屬已知種有菲牛蛭Poecilobdella manillensis Lesson 顆粒牛蛭Poecilobdella granulosa，湖北牛蛭Pecilobdella1 hubeiensis 和Poecilobdella viridis。1968年國外Keegan［1］對東南亞的菲牛蛭生活習慣進行觀察。1992年Steiner［2］從產(chǎn)自馬尼拉的菲牛蛭中分離純化新的水蛭素, 測定其原始結構和功能表明有抗凝活性。1993 年Scacheri［3］從菲牛蛭中分離出2 種水蛭素變異體, 測定其氨基酸序列，cDNA 克隆和表達, 表達產(chǎn)物有抗凝活性。2002 年譚恩光等［4］從廣東產(chǎn)的菲牛蛭基因組中PCR擴增出水蛭素基因, 并克隆和測序。在此，本文僅對我國菲牛蛭的一些研究進行綜述，為開發(fā)菲牛蛭資源提供參考。 1 菲牛蛭地理分布、野生資源情況、生態(tài)習性和采收季節(jié) 菲牛蛭主要分布在菲律賓、泰國、越南等東南亞地區(qū)及中國的東南、中部和西南部地區(qū)。由于有關我國菲牛蛭地理分布、野生資源情況以及生態(tài)習性和采收季節(jié)相關報道很少，因此，我們對廣西區(qū)內(nèi)具有代表性的靈川、象州、岑溪、博白、防城、隆安、田東等15個縣（市）的菲牛蛭品種生物學特征、資源數(shù)量分布、生態(tài)習性和采收季節(jié)進行調(diào)查，共收集到水蛭樣品15份。經(jīng)外貌與形態(tài)特征的初步鑒定，與我國水蛭分類學專家楊潼所描述的菲牛蛭相同，說明區(qū)內(nèi)分布的水蛭以菲牛蛭品種為主。分布在區(qū)內(nèi)各地的菲牛蛭，經(jīng)體重測定差異不顯著，但在數(shù)量上桂東南地區(qū)明顯多于桂西北，欽州、防城野生資源比較豐富，羅城、巴馬等地野生資源稀少。數(shù)量分布的多寡與溫度、雨量、濕度等氣候因素有關，符合水蛭喜溫、濕、熱的特性。通過樣品的收集為優(yōu)化種苗選擇提供了豐富的物質(zhì)基礎。 菲牛蛭生態(tài)環(huán)境要求和生態(tài)習性：根據(jù)野外的考察表明，菲牛蛭喜歡在土壤含鐵量較高、水體呈弱酸性（pH值5.5～7.0）的環(huán)境中繁衍。在野外多發(fā)現(xiàn)于荒蕪的山塘和山?jīng)_田塊或濕草地，尤其是土層深厚、土質(zhì)疏松潮濕,各種水草生長旺盛,并且經(jīng)常有耕牛、人活動，呈土畦式水體相對固定的環(huán)境中多見，常年耕作的田塊和已開發(fā)養(yǎng)殖的山塘或大面積連體的水體中很少發(fā)現(xiàn)。 菲牛蛭的采收季節(jié)：經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，菲牛蛭對溫度反應敏感。水溫在25～30℃時，活動最活躍，生長最快，也是繁殖的季節(jié)。在野外當水溫低于15℃時便停止活動，因此，每年的11月前后到次年的4月前后很少發(fā)現(xiàn)有菲牛蛭在水中活動，這時它們都進入泥土里越冬，這與其為冷血變溫動物，冬季具有冬眠習性相一致。這樣菲牛蛭的采收時間宜選擇在9～10月份，此時，氣溫下降，菲牛蛭生長速度減慢，但仍在水中，易于捕捉。 2 菲牛蛭的化學成分 2.1 菲牛蛭中脂肪酸分析苗艷麗等［5］對廣西產(chǎn)菲牛蛭脂肪酸提取液進行氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)分析,共分離出19 個峰。與標準譜庫對照分析,鑒定了16個組分, 脂肪酸的相對含量采用總離子流各色譜峰面積歸一化法定量,結果見表1。實驗共鑒定了菲牛蛭中脂肪酸的16個組分,占脂肪酸總量的97. 39 % ,其中飽和脂肪酸占63.34%，不飽和脂肪酸占34.05%。飽和脂肪酸主要有硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸等;不飽和脂肪酸主要包括油酸、11 - 二十碳烯酸等。其中含量最多的是十六烷酸，達到23.78%，其次是9 - 十八碳烯酸,含量為12.53%；11 - 二十碳烯酸含量為11.75%。菲牛蛭中所含的單不飽和脂肪酸,如9 - 十八碳烯酸和11 - 二十碳烯酸的含量高于中藥螞蟥中的含量［6］。 表1 菲牛蛭中脂肪酸的組成及含量 序號脂肪酸 分子式(甲脂)相對含量( % )13 - 甲基十三酸C15H30O21. 022十四酸(肉豆蔻酸) C15H30O22.8834, 8, 12 - 三甲十三酸C17H34O27. 434十四酸(異構體)C15H34O20. 655十五酸C16H32O21. 48614 - 甲基十五酸C17H34O2 1.279 - 十六烯酸C17H32O23. 968十六酸(棕櫚酸) C17H34O2 23.78915 - 甲基- 十六酸C18H36O26.091014 - 甲基- 十六酸C18H36O23.6511十七酸 C18H36O22.78123，7，11，15 - 四甲基十六酸 C21H42O21.77139 - 十八烯酸C19H36O212. 53148 - 十八烯酸C19H36O25. 8115十八酸(硬脂酸)C19H38O210.611611 - 二十烯酸C21H40O211.75 2.2 菲牛蛭中氨基酸的分析苗艷麗等［5］采用HPLC法，測定廣西產(chǎn)菲牛蛭提取液中的氨基酸。并采用內(nèi)標法進行含量測定,結果見表2。測定結果表明菲牛蛭中含有18種氨基酸，甘氨酸的含量最高為5 392.70 μg/g，其次是亮氨酸含量為2 340.59 μg/g。其中含有人體必需的7種氨基酸,這7種必需氨基酸含量為5 536.28 μg/g，占氨基酸總量的28.16%；高于其他水蛭（日本醫(yī)蛭為22.50%，螞蟥為21. 40%）［7］中必需氨基酸的含量。 表2 菲牛蛭中氨基酸的組成及含量μg·g-1 氨基酸含量氨基酸含量△天門冬氨酸2 142.24胱氨酸687.72谷氨酸205.65* 纈氨酸 512.65絲氨酸606. 21* 蛋氨酸213.35組氨酸398. 94色氨酸320.26△甘氨酸 5 392. 70* 苯丙氨酸383.02* 蘇氨酸520. 21* 異亮氨酸 1401.29△丙氨酸1 478. 56賴氨酸899. 29△精氨酸 1 637. 35△* 亮氨酸2 340.59* 酪氨酸165. 17脯氨酸353.74 *為人體必需氨基酸；△：為含量較高的氨基酸 3 菲牛蛭的生物活性成分及其藥理學作用 3.1 菲牛蛭素(Bufrudin)［8］菲牛蛭素是從菲牛蛭分出的一種多肽,由60多個氨基酸組成,分子量7 000 D，序列分析表明,其中50%～60%的氨基酸殘基與水蛭素相同。其立體結構和構型有待進一步研究。它的作用機理與水蛭素(Hirudin)、森林山蛭素(Haemadin) 相同，都是抑制凝血酶［9］。 黃愛民等［10］從廣西產(chǎn)菲牛蛭消化液中分離出兩種特異凝血酶抑制劑-菲牛蛭素A（Bufrudin A ,BDA）、菲牛蛭素B（Bufrudin B ,BDB）。BDA分子量約為15.2KD，等電點為3.97；BDB分子量為14.6 KD，等電點為4.61。紫外掃描發(fā)現(xiàn)，BDA在230 nm處有最大吸收，而BDB的最大吸收則在200～210 nm之間。每1 000 ml水蛭消化液可以分離出菲牛蛭素A 630 μg, 菲牛蛭素B 615 μg，收率菲牛蛭素A約為0.303％； 菲牛蛭素B約為0.300%。 3.1.1 菲牛蛭及活性成分的抗凝血作用黃愛民等［11］用廣西菲牛蛭中提取的兩種菲牛蛭素（菲牛蛭素A和B）在體外及動物體內(nèi)進行抗凝血實驗，結果表明：菲牛蛭素A和B均能明顯延長活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）及凝血酶時間（TT），但兩者的3個指標有明顯差異性，其中菲牛蛭素A對凝血酶時間（TT）的作用最顯著，菲牛蛭素B則凝血酶原時間（PT）的作用更強。對于凝血因子，菲牛蛭素A對Ⅱ，Ⅷ，Ⅻ因子產(chǎn)生抑制作用，對Ⅴ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ因子無影響；菲牛蛭素B則對Ⅱ，Ⅷ，Ⅹ，Ⅻ因子產(chǎn)生抑制作用,對Ⅴ，Ⅸ，Ⅺ因子無影響。廣西菲牛蛭中的抗凝物質(zhì)BDA、BDB均有很強的抗凝活性。 此外，李文等［12］用7種水蛭進行全血與血漿復鈣時間試驗，證實日本醫(yī)蛭與菲牛蛭都表現(xiàn)了強大的抗凝血作用(樣品在10 min測試時間內(nèi)不凝)。湖北牛蛭的抗凝效果也十分突出。 3.1.2 菲牛蛭及活性成分的抗血栓作用吳志軍等［13］采用大鼠靜脈血栓模型，研究了菲牛蛭制品的抗血栓與溶血栓作用。結果表明，陽性藥腦血康和4種不同物種的水蛭凍干粉樣品具有明顯的抗血栓作用，各物種抗血栓作用強度依次為菲牛蛭凍干粉>日本醫(yī)蛭凍干粉>歐洲醫(yī)蛭凍干粉>寬體金線蛭凍干粉；同等劑量的菲牛蛭全身凍干粉樣品和陽性藥腦血康具有相當?shù)目寡ㄅc溶血栓作用，而菲牛蛭頭部段凍干粉則比前兩者溶血栓效果更佳。 黎淵弘等［14］用廣西菲牛蛭提取物對家兔體外血栓、動脈血栓及大鼠靜脈血栓進行抗血栓研究,結果表明，大(1.5 ATU),中(0.75 ATU)，小(0.5 ATU)劑量組與對照組相比，菲牛蛭提取物對家兔體外血栓形成有顯著性差異（P< 0.05）,血栓抑制率為24.3%～100%。與對照組比較，給藥組藥后10，15 min對大鼠半體內(nèi)血栓形成影響有顯著性差異(P<0.05),血栓的濕重明顯減小或完全消失。大鼠靜注菲牛蛭提取物60 ATU/kg后,大鼠靜脈血栓形成率為0，血栓干濕重為0,與對照組比較有非常顯著性差異(P<0.01)。家兔靜注菲牛蛭提取物60 ATU/kg前和給藥后15，30，45 min，家兔動脈血栓干濕重有顯著性差異(P<0.05)，藥物作用時間為1 h。 3.2 纖維蛋白溶解酶 筆者采用纖維蛋白平板法［15］定性測定廣西產(chǎn)菲牛蛭唾液提取液纖維蛋白溶解酶。結果表明：在標準平板和加熱平板上加入廣西產(chǎn)菲牛蛭唾液提取液20 μl后，溶圈直徑為0.6 cm，表明能溶解纖維蛋白。而尿激酶20 μl在標準平板上有較強的纖溶作用（溶圈直徑為1.3 cm），在加熱平板上無纖溶作用（溶圈直徑為0）。說明菲牛蛭唾液提取液的纖溶機制與尿激酶不同，是以直接纖溶為主。菲牛蛭唾液提取液經(jīng)過10%～100%硫酸銨處理，部分蛋白被沉淀，由于硫酸銨的量不同，溶圈大小也不同。10%硫酸銨處理樣品上清液的溶圈直徑最大，80%硫酸銨處理樣品上清液的溶圈直徑最小。 3.3 抗血小板聚集活性成分 李文等［12］從7種水蛭對抗ADP或膠原誘導的血小板聚集的結果表明：日本醫(yī)蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表現(xiàn)了抗血小板聚集的作用。其中以日本醫(yī)蛭的效果最佳。在3.08 mg/ml濃度下已表現(xiàn)抑制ADP誘導聚集的作用；其次為菲牛蛭，在9.23 mg/ml時對血小板最大聚集率（PAm，%） 和1 min時血小板聚集率（Par，%） 都表現(xiàn)了顯著抑制；湖北牛蛭的抑制ADP誘導血小板聚集作用則需要較高濃度。筆者也發(fā)現(xiàn)，25 μl廣西產(chǎn)菲牛蛭唾液提取液對ADP誘導的聚集表現(xiàn)90%的抑制。 3.4 抑菌活性成分 廣西菲牛蛭唾液粗提液未發(fā)現(xiàn)抑菌活性，但是經(jīng)過離心處理，對金色葡萄球菌有抑制作用，抑菌圈直徑為1.0 cm。可能是因為粗樣中成分多而雜，進行抑菌檢測時干擾大，而導致陰性結果。經(jīng)過離心，干擾蛋白被沉淀分離，顯示陽性結果。 4 菲牛蛭粗品和菲牛蛭素精品的制備［11］ 4.1 提取粗品先配制提取液，然后讓菲牛蛭吸吮，待菲牛蛭充分吸飽后，再將其擠壓，收集唾液（水蛭素粗品），每隔3周可提取1次，每條可以反復提取5～6次，最后還可將整體凍干后粉碎作最后的提取。 4.2 廣西菲牛蛭素精品的分離純化 4.2.1 廣西菲牛蛭素的粗提取廣西菲牛蛭唾液提取液1 000 ml，用三氯醋酸進行酸沉；4℃，8 000 r/min 離心30 min，棄沉淀，取上清液65～70℃保溫30 min，適當攪拌；調(diào)pH值至中性，4℃，8 000 r/min離心10 min，棄沉淀，保留上清液。 4.2.2 廣西菲牛蛭素的提取純化 4.2.2.1 DEAE-纖維素柱層析選用的層析柱長為30 cm，直徑2.6 cm。將上清液加到已用0.02 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）平衡的DEAE-纖維素柱上，以0～1 mol·L-1 NaCl 1 000 ml進行線性梯度洗脫，流速為1 ml·min-1，以每管10 ml收集各蛋白峰，按Markwardt凝血酶滴定法測定各管蛋白峰的活性，收集具有抗凝活性的A1峰及B1峰。 4.2.2.2 Sephadex G-50 凝膠過濾柱層析選用的層析柱柱長為100 cm，直徑1.6 cm。取濃縮后的DEAE-纖維素柱的A1峰和B1峰，分離上樣于已用0.02 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH5.5）平衡的Sephadex G-50柱上，用相同緩沖液洗脫，流速為0.3 ml·min-1，每管10 ml收集蛋白峰，同法測定各蛋白峰的抗凝活性，分別收集具有抗凝活性的A2，B2峰。 4.2.2.3 反相HPLC進一步純化采用Waters 2487 Dual λAbsorbance Detector ,Waters 600 controller ,WatersTM600 Pump. 在UV210 nm下，選用制備型ULTRASPHERE ODS C18柱（10 mm×25 cm），將DEAE-纖維素柱洗脫的活性峰成分A2，B2透析濃縮后分別進樣。用0.1%TFA水溶液充分平衡后，以30 min 0～60%的乙腈(含0.1% TFA)線性梯度洗脫，流速為3 ml·min-1)洗脫，分別收集抗凝活性峰A3，B3，凍干后即得具有抗凝活性的物質(zhì)BDA，BDB。 5 菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列測定 譚恩光等［4］以我國廣東菲牛蛭為材料，研究地理因素對菲牛蛭水蛭素基因結構變異的影響。研究表明：廣東菲牛蛭水蛭素基因（Hmg）全長642 bp，與馬尼拉的菲牛蛭水蛭素基因Hm1 和Hm2同源性分別為9O％和88.6％ 。從整個多肽鏈看來，廣東菲牛蛭水蛭素基因序列，也具有如下特征：①Hmg的N端第6，13，15，21，27和36位為半胱氨酸，推測這6個半胱氨酸將形成3對二硫鍵，對分子構型起穩(wěn)定作用；②Hmg亦含1個富酸性羧基末端片段。此片段中有7個酸性氨基酸，為分別位于50、54、55、59的谷氨酸和位于52，58，60的天冬氨酸。酸性羧基末端片段與凝血酶的識別部位結合，即帶負電的羧基末端氨基酸殘基和凝血酶分子結構中帶正電氨基酸形成的凹槽 離子鍵相互作用是復合物形成關鍵一步，也是發(fā)揮功能的重要一步；③ 肽鏈中部還有一個由Prc-Lys44——Pro組成的特殊序列，此3個殘基與凝血酶活性部位裂縫相互作用，抑制了此酶的功能［16～18］。此外廣東菲牛蛭水蛭素羧基端不存在來自醫(yī)蛭素中的磺酸化修飾的Tyr，代之是He，這表明水蛭不同科之間，蛭素基因的翻譯后修飾進化方式不同。 6 菲牛蛭中有害物質(zhì)含量和急性毒性 吳志軍等［13］測定了菲牛蛭中有害物質(zhì)含量和急性毒性試驗。結果表明：3批不同批號菲牛蛭樣品中銅、鉻、砷、汞、鉛 5種有害重金屬元素含量總和< 20 mg/kg，砷元素含量< 2 mkg，有機氯類和有機磷類農(nóng)藥殘留量均很低。急性毒性：LD >10 g/kg。菲牛蛭中重金屬含量和有機氯以及有機磷農(nóng)藥殘留量均符合國家有關要求，菲牛蛭可考慮作為一種新的藥用資源加以研究。 我國有水蛭近百種，但《中國藥典》(1995年版)只收載3種，而市場上出售的水蛭藥材實際只有寬體金線蛭一種。筆者認為，對其它品種的水蛭尤其是吸血水蛭例如菲牛蛭等，有必要進行多學科的綜合研究，以擴大入藥水蛭的品種，造福于人類。 【參考文獻】 ［1］ Keegan H L , Toshioka S, Suzuk i H. 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