【研究意義】喹諾酮類（quinolones，QNS）和慶大霉素（gentamicin，GEN）均為廣譜、高效抗菌藥物，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都具有顯著的作用，因此是豬、雞、魚(yú)、蝦等動(dòng)物養(yǎng)殖中常用的獸藥品種，也常作為藥物添加劑添加到飼料中促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[1-2]。隨著這兩類藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的不斷應(yīng)用，其殘留問(wèn)題日趨嚴(yán)重，在動(dòng)物性食品中的殘留不僅危害人的身體健康，如QNS可引起惡心，嘔吐，影響軟骨發(fā)育，GEN具有耳毒性和腎毒性，還污染環(huán)境、影響新藥開(kāi)發(fā)和臨床用藥，而且不利于養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展及畜禽產(chǎn)品的出口；更為嚴(yán)重的是，這兩類藥物為人畜共用藥物，動(dòng)物性食品中殘留較低濃度的藥物容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性。為嚴(yán)格控制這兩類抗生素在動(dòng)物源食品中的殘留，保證人民身體健康，保證進(jìn)出口產(chǎn)品質(zhì)量，提高中國(guó)畜產(chǎn)品的國(guó)際信譽(yù)，中國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告對(duì)這兩類藥物在動(dòng)物源性食品中的最高殘留限量均作了明確規(guī)定[3]。因此，研究這兩類藥物的殘留檢測(cè)方法對(duì)中國(guó)的食品安全監(jiān)測(cè)具有非常重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國(guó)內(nèi)外用于動(dòng)物源性食品中QNS和GEN殘留檢測(cè)的分析方法主要有微生物法[4]、放射化學(xué)法[5]、免疫分析法[6-10]（包括放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、熒光免疫法、免疫傳感器和蛋白芯片）、薄層色譜法[11]、毛細(xì)管電泳色譜法[12-13]、高效液相色譜法[14-16]、氣相色譜-質(zhì)譜法[17]、液相色譜-質(zhì)譜法[18-20]等。微生物方法所需設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，適合于大批樣品的檢測(cè)；但是該法存在菌種不易篩選，影響因素復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、穩(wěn)定性差、精確度和靈敏度低的特點(diǎn)，往往不能滿足目前實(shí)際檢測(cè)工作的要求。高效液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用等方法靈敏度高，可以提供定量及確證分析，但是前處理復(fù)雜，需要昂貴的儀器，且對(duì)操作人員有專業(yè)的要求，不適合基層檢測(cè)分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】免疫分析法是近年來(lái)快速發(fā)展的一種方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、適用范圍廣、操作簡(jiǎn)便、快捷、成本低廉及現(xiàn)場(chǎng)適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。膠體金免疫層析法與其他免疫方法如ELISA相比，樣品前處理簡(jiǎn)單，不需要任何儀器，結(jié)果可在5—10min內(nèi)獲得，且對(duì)操作人員沒(méi)有專業(yè)要求，非常適合現(xiàn)場(chǎng)大批量樣本的篩選。但目前國(guó)內(nèi)外還未出現(xiàn)可同時(shí)檢測(cè)QNS和GEN兩類藥物的膠體金免疫方法的報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立同時(shí)檢測(cè)牛奶中QNS和GEN兩類藥物殘留的膠體金免疫層析方法。

1材料與方法

本試驗(yàn)于2013年1—7月在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)中心及北京維德維康生物技術(shù)有限公司完成。

1.1 主要試劑和儀器

QNS單抗和抗原、GEN單抗和抗原均由北京維德維康生物技術(shù)有限公司制備。GEN、鏈霉素（streptomycin，STR）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、新霉素（neomycin，NEO）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、氟甲喹（flumequine，FLU）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、二氟沙星（difloxacin，DIF），購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、噁喹酸（oxolinicacid，OA）、麻保沙星（marbofloxacin，MAR），氟羅沙星（fleroxacin，FUL）、奧比沙星（orbifloxacin，ORB）、依諾沙星（enoxacin，ENO）、達(dá)氟沙星（danofloxacin，DAN）、洛美沙星（lomefloxacin，LOM）、司帕沙星（sparfloxacin，SPA）、帕珠沙星（pazufloxacin，PAZ）、牛血清蛋白（Bovineserumalbumin，BSA），氯金酸等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜，美國(guó)Millipore公司；吸水紙、PVC底板等購(gòu)自上海金標(biāo)公司。

恒溫磁力攪拌器，德國(guó)Heigoph公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Kendro公司；電子分析天平，Mettler-Toledo儀器公司；微電腦自動(dòng)斬切機(jī)ZQ2000，上海金標(biāo)公司；B-3060噴膜平臺(tái)，美國(guó)BioDot公司，冷凍干燥機(jī)FD-1B-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備[21]。取100mL雙蒸水加熱至沸騰，在持續(xù)攪拌的情況下加入1mL1%（w/v）的氯金酸，等水再次沸騰以后，取2mL1%（w/v）的檸檬酸三鈉，一次性快速加入錐形瓶中。繼續(xù)攪拌加熱15min，直至溶液呈透亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)到原體積，4保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 金標(biāo)抗體的制備

本研究采用棋盤法確定抗體標(biāo)記的最佳pH值和最佳抗體用量。將裝有100mL膠體金溶液的潔凈小燒杯置于磁力攪拌器上并攪拌，用0.1mol·L-1K2CO3調(diào)pH值至8.5，然后逐滴加入10mL用雙蒸水稀釋的混合抗體，攪拌10min后，加入20%（w/v）BSA溶液2mL，繼續(xù)攪拌10min，412000r/min離心30min，棄上清，用0.02mol·L-1PBS（5%蔗糖，1%BSA，0.5%吐溫20，pH7.4）將管底紅色沉淀懸溶至100mL，將懸溶好的金溶液加入到潔凈酶標(biāo)微孔中，每孔加入40μL，然后放入冷凍干燥機(jī)中冷凍過(guò)夜，將凍好的金標(biāo)微孔用鋁箔袋密封好待用。

1.4 抗原包被液和包被

條件的選擇分別采用0.05mol·L-1pH9.6的碳酸鹽緩沖液（Carbonatebuffer，CB）、0.01mol·L-1pH9.0的Tris-HCl緩沖液和0.01mol·L-1pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為包被緩沖液，將包被原稀釋后用BioDot-3060噴在NC膜上，比較三者檢測(cè)線顏色深淺及靈敏度；分別將噴有包被原的NC膜置于37干燥2h或37干燥過(guò)夜，比較兩者檢測(cè)線顏色深淺及靈敏度。

1.5 檢測(cè)過(guò)程取

200μL新鮮奶樣加入微孔金中，輕輕來(lái)回吹打3—4次使微孔金完全溶解后，將組裝好的試紙條插入微孔中，5min后即可觀察結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.6 試紙條參數(shù)確認(rèn)

1.6.1 檢測(cè)限隨機(jī)抽取120份經(jīng)國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)中心檢測(cè)不含QNS和GEN的陰性牛奶樣本，抽出100份樣本平均分成5組，用ENR和GEN標(biāo)準(zhǔn)品工作液添加5個(gè)濃度梯度，分別為5-5、10-10、20-20、50-50、100-100ng·mL-1，另20份樣本做陰性對(duì)照。共3個(gè)批次，兩個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。將T1、T2檢測(cè)線剛好完全消失的濃度定為檢測(cè)限。

1.6.2 交叉反應(yīng)分別將上述17種喹諾酮類藥物和4種氨基糖苷類藥物工作液作系列稀釋：即100、50、20、10、5ng·mL-1，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，分別用試紙條進(jìn)行測(cè)試。

1.7 盲樣檢測(cè)

為了鑒定試紙條的準(zhǔn)確性與可靠性，從國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)中心隨機(jī)抽取60份奶樣，并用膠體金試紙條、《SN/T1751.2—2007進(jìn)出口動(dòng)物源食品中喹諾酮類藥物殘留量檢測(cè)方法第2部分：液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》和《GB/T21323—2007動(dòng)物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測(cè)定高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》對(duì)牛奶中QNS和GEN的含量進(jìn)行檢測(cè)并比對(duì)結(jié)果。

2結(jié)果

2.1膠體金顆粒選擇本研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液。膠體金顆粒大小與檸檬酸三鈉的加入量有關(guān)。隨著加入的檸檬酸的量增加，膠體金的最大吸收波長(zhǎng)下降。但加入的檸檬酸鈉的量超過(guò)2.5mL,最大吸收波長(zhǎng)基本不變。膠體金顆粒大小對(duì)試紙條的靈敏度和顯色的影響見(jiàn)表1。

由表1可知，加入2mL1%檸檬酸三鈉時(shí)，試紙條的顯色和檢測(cè)限可達(dá)到最佳狀態(tài)。且該條件下制備的膠體金顆粒均一，粒徑適中，因此隨后實(shí)驗(yàn)均采用該條件下制備的膠體金溶液。

2.2金標(biāo)抗體最佳pH值和最佳蛋白用量的篩選結(jié)果采用方陣法測(cè)定的pH值和抗體蛋白用量對(duì)試紙條檢測(cè)限影響的結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，pH值的改變對(duì)靈敏度的影響很大，當(dāng)pH為5.5時(shí)，抗體不能和膠體金偶聯(lián)，偶聯(lián)過(guò)程膠體金溶液即分解變色。而當(dāng)抗體用量降低至5μg·mL-1時(shí)，制得的金標(biāo)抗體不穩(wěn)定。當(dāng)pH值在6.5—7.5之間，抗體用量為10—30μg·mL-1，試紙條檢測(cè)線均顯色，但加入50ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)線仍不消失。當(dāng)pH值在8.5—9.5之間，靈敏度明顯上升，檢測(cè)限均能達(dá)到20ng·mL-1。但pH8.5的顯色明顯強(qiáng)于pH9.0以上。因此，在初步優(yōu)化的基礎(chǔ)上對(duì)偶聯(lián)pH值和抗體用量進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)pH為8.5，抗體用量為10μg·mL-1膠體金時(shí)，試紙條檢測(cè)限和顯色均達(dá)到最佳狀態(tài)。

2.3包被液和包被條件的選擇

包被液和包被條件對(duì)試紙條顯色和檢測(cè)限的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，采用PBS作包被液較之CB和Tris-HCL效果更好，說(shuō)明鹽離子濃度和pH值可影響包被原在NC膜上的吸附效果。噴涂包被原的NC膜37干燥2h或37干燥過(guò)夜檢測(cè)線顯色深淺和靈敏度均相當(dāng)，因此，為節(jié)約操作時(shí)間，選擇37干燥2h的方式進(jìn)行包被。

2.4試紙條參數(shù)的確定

2.4.1檢測(cè)限確定采用系列濃度添加的奶樣進(jìn)行試紙條的跑樣，確定試紙條的檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)圖2。

陰性對(duì)照控制線和檢測(cè)線均顯色，當(dāng)ENR和GEN的添加濃度均為5ng·mL-1時(shí)，檢測(cè)線顯色明顯變淺，滴加20-20ng·mL-1以上濃度時(shí)，T1和T2檢測(cè)線則完全消失。因此試紙條檢測(cè)牛奶樣本中ENR和GEN的檢測(cè)限可定為20ng·mL-1。

2.4.2交叉反應(yīng)試驗(yàn)試紙條的交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

試紙條對(duì)氨基糖苷類的其他3種藥物KAN、NEO、STR無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)QNS如CIP、NOR、FLU、PEF、OFL、ENO、OA、MAR、FUL、ORB、DAN、LOM的交叉反應(yīng)明顯，且對(duì)這12種藥物的檢測(cè)限均可定為20ng·mL-1。對(duì)其余QNS如SAR、DIP、SPA、PAZ均無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5盲樣檢測(cè)

隨機(jī)抽取60份盲樣，分別用HPLC-MS/MS與試紙條方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。用HPLC-MS/MS共檢測(cè)出6個(gè)陽(yáng)性樣本。其中，檢測(cè)10號(hào)樣本含GEN156ng·mL-1，17號(hào)樣本含GEN98ng·mL-1，26號(hào)樣本含OFL12.5ng·mL-1，33號(hào)樣本含GEN64ng·mL-1，45號(hào)樣本含GEN189ng·mL-1，52號(hào)樣本含OFL45ng·mL-1，其他樣本均為陰性，試紙條的檢測(cè)結(jié)果與HPLC-MS/MS的檢測(cè)結(jié)果完全吻合。結(jié)果表明篩選方法可將陽(yáng)性樣本全部檢出，且未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性現(xiàn)象。部分盲樣的試紙條檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

3討論

本研究首次報(bào)道了膠體金免疫層析方法同時(shí)檢測(cè)牛奶中QNS和GEN的殘留。2005年，Jin等[22]報(bào)道了牛奶和血漿中GEN殘留檢測(cè)的膠體金免疫方法，2008年，Zhu等[2]報(bào)道了雞肉組織中12種QNS殘留檢測(cè)的膠體金方法。膠體金顆粒與抗體蛋白標(biāo)記過(guò)程中，一般采取一對(duì)一的方式，即將單個(gè)抗體蛋白與膠體金顆粒進(jìn)行標(biāo)記，這種方式既比較容易實(shí)現(xiàn)，同時(shí)標(biāo)記的抗體也比較穩(wěn)定。本研究為了能在一個(gè)試紙條上同時(shí)檢測(cè)兩類藥物，先將單個(gè)抗體蛋白與膠體金顆粒進(jìn)行標(biāo)記，在確定單個(gè)抗體蛋白標(biāo)記的最佳pH和最佳抗體用量后，先選定一個(gè)適合兩個(gè)抗體蛋白同時(shí)標(biāo)記的pH值，然后將兩個(gè)抗體蛋白按一定比例混合，這個(gè)比例范圍可以從9﹕1到1﹕1進(jìn)行摸索。在確定兩個(gè)抗體蛋白的最佳比例用量后，再返回摸索抗體標(biāo)記的最佳pH值。本研究同時(shí)對(duì)比了抗體蛋白進(jìn)行單獨(dú)標(biāo)記后再混合在一起的檢測(cè)效果。結(jié)果表明：混合標(biāo)記比單獨(dú)標(biāo)記再混合的金標(biāo)抗體更加穩(wěn)定，試紙條顯色顏色更加均一和一致。單獨(dú)標(biāo)記的金標(biāo)抗體混合后，顯色效果和檢測(cè)限不一定與單獨(dú)標(biāo)記時(shí)一致，最主要的問(wèn)題還是金標(biāo)抗體不如混合標(biāo)記穩(wěn)定，這可能與兩個(gè)抗體與膠體金顆粒結(jié)合的電荷是否平衡有關(guān)系。單獨(dú)標(biāo)記再混合，可能有一個(gè)電荷再平衡的過(guò)程，所以導(dǎo)致不穩(wěn)定。當(dāng)然這種混合標(biāo)記的前提必須建立在兩個(gè)或多個(gè)抗體蛋白單獨(dú)標(biāo)記時(shí)最佳pH相同或接近的情況下，這取決于抗體的特性和效價(jià)。這種一個(gè)試紙條進(jìn)行多殘留檢測(cè)的模式，是今后膠體金免疫層析方法發(fā)展的趨勢(shì)。

本試驗(yàn)對(duì)試紙條上包被GEN和QNS抗原的位置進(jìn)行了研究。首先將GEN抗原包被在TI位置，QNS抗原包被在T2位置，然后互換位置進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)顯色和抑制沒(méi)有差異。

為了驗(yàn)證多種抗體蛋白混合標(biāo)記的穩(wěn)定性，本研究對(duì)凍干金標(biāo)抗體進(jìn)行了加速穩(wěn)定性試驗(yàn)。將凍干金標(biāo)抗體45烘烤15d后，發(fā)現(xiàn)試紙條的顯色和抑制情況與450d的結(jié)果基本沒(méi)差異，結(jié)果證明了這種混合標(biāo)記法的可行性。

試驗(yàn)中采用膠體金免疫層析法、HPLC-MS/MS法對(duì)牛奶樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，采用這兩種方法，陽(yáng)性樣品全部檢出，同時(shí)篩選方法未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性現(xiàn)象，說(shuō)明二者的測(cè)定結(jié)果基本相符。實(shí)際操作過(guò)程中，可以采用膠體金免疫層析對(duì)樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速初篩，篩選的疑似陽(yáng)性樣品，可以采用HPLC-MS/MS方法對(duì)樣品中QNS和GEN的含量進(jìn)一步確認(rèn)。

4結(jié)論

本研究成功建立了可同時(shí)檢測(cè)牛奶中13種QNS和GEN殘留的膠體金免疫層析方法。試驗(yàn)結(jié)果表明該方法對(duì)牛奶中13種QNS和GEN的檢測(cè)限均為20ng·mL-1。牛奶樣本直接檢測(cè)，無(wú)需處理，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程5min內(nèi)完成。采用該研制的試紙條和理化分析方法對(duì)抽檢牛奶樣本進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果表明，二者的測(cè)定結(jié)果基本相符，表明該試紙條檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣本的快速檢測(cè)和篩選。