【討論】膠體金論壇

誰能拯救我110 2014-05-08

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膠體金是一種常用的標記技術，有其獨特的優(yōu)點。近年已在各種生物學研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術幾乎都使用其標記。同時在流式、電鏡、免疫、分子生物學以至生物芯片中都可能例用到。
　　1971年Faulk 和Taytor將膠體金引人免疫化學，此后免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法，在生物醫(yī)學各領域得到了日益廣泛的應用。目前在醫(yī)學檢驗中的應用主要是免疫層析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于檢測 HBsAg、HCG 和抗雙鏈ＤＮＡ抗體等，具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點。
免疫膠體金技術的基本原理
　　氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。
　　免疫金標記技術(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。
　　
膠體金的制備方法
　　
　　膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。下面介紹最常用的制備方法及注意事項。
　　１、玻璃容器的清潔：玻璃表面少量的污染會干擾膠體金顆粒的生成，一切玻璃容器應絕對清潔，用前經(jīng)過酸洗、硅化。硅化過程一般是將玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。專用的清潔器皿以第一次生成的膠體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸餾水淋洗，可代替硅化處理。
　　２、試劑、水質(zhì)和環(huán)境：氯金酸極易吸潮，對金屬有強烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其１％水溶液在４℃可穩(wěn)定數(shù)月不變。實驗用水一般用雙蒸餾水。實驗室中的塵粒要盡量減少，否則實驗的結果將缺乏重復性。
　　金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變，應選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng)，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH3～5.8)、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5～10.3)等緩沖系統(tǒng)。但應注意不應使緩沖液濃度過高而使金溶膠自凝。
　　３、檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠：
　　取0.01％氯金酸水溶液100ml 加熱至沸，攪動下準確加入１％檸檬酸三鈉水溶液 0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在２分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸１５分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區(qū)最高吸收峰在535nm，Ａ1cm/535=1.12。金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見的顯著的顏色變化，這就是金溶膠用于免疫沉淀或稱免疫凝集試驗的基礎。
　　金溶膠顆粒的直徑和制備時加入的檸檬酸三鈉量是密切相關的，保持其他條件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒徑的金溶膠，見附表。
附表 100 ml 氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響
１％檸檬酸三鈉ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00
金溶膠顏色藍灰紫灰紫紅紅橙紅橙
吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518
徑粒(nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15
　?。?、檸檬酸三鈉－鞣酸混合還原劑：用此混合還原劑可以得到比較滿意的金溶膠，操作方法如下：取 4ml１％檸檬酸三鈉 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入0～5ml１％鞣酸，0～5ml 25mmo/L K2CO2（體積與鞣酸加入量相等），以雙蒸餾水補至溶液最終體積為20ml，加熱至60℃取1ml１％的 HAuCl4，加于79ml雙蒸餾水中，水浴加熱至60℃，然后迅速將上述檸檬酸－鞣酸溶液加入，于此溫度下保持一定時間，待溶液顏色變成深紅色(約需0.5～1小時)后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰５分鐘即可。改變鞣酸的加入量，制得的膠體顆粒大小不同。
　　５、白磷還原法：在120ml雙蒸餾水中加入1.5ml１％氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一飽和度的白磷乙醚溶液，混勻后室溫放置15分鐘，在回流下煮沸直至紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。此法制得的膠體金直徑約 6nm，并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實驗室不宜采用。
　　要得到大小更均勻的膠體金顆粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度離心，經(jīng)分級后制得膠體金顆粒直徑的變異系數(shù)（ＣＶ）可小于１５％。
免疫膠體金制備
　?。?、蛋白質(zhì)的處理：由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應先對低離子強度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應絕對澄清無細小微粒，否則應先用微孔濾膜或超速離心除去。
　　一般情況下應避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因為它們都可吸附于顆粒表面而減弱膠體金對蛋白質(zhì)的吸附。
　　２、蛋白質(zhì)最適用量的選擇：將待標記的蛋白質(zhì)儲存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質(zhì)5～40ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設一管不加蛋白質(zhì)的對照管，５分鐘后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置２小時，不穩(wěn)定的金溶膠將發(fā)生聚沉，能使膠體金穩(wěn)定的最適蛋白量再加10％即為最佳標記蛋白量。
　?。?、標記：在接近并略為高于蛋白質(zhì)等電點的條件下標記是比較合適的，在此情況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大。
　　下述標記步驟最為常見：
　?、儆?.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH(標記ＳＰＡ時調(diào)到pH6.0)。
　?、谟?00ml 金溶膠中加入最佳標記量的蛋白質(zhì)溶液（體積為２～３ml），攪拌２～３分鐘。
　?、奂尤?ml１％PEG20000溶液。
　?、苡?0000～100000g離心30～60分鐘（根據(jù)粒徑大小選擇不同離心條件），小心吸去上清液（切忌傾倒）。
　?、輰⒊恋響腋∮谝欢w積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復，濃度以Ａ1cm/540nm=1.5左右為宜，以 0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4℃保存。
　?、薨缓蟮慕鹑苣z也可濃縮后于Sephadex G-200柱進行凝膠層析分離純化，以含 0.1％ＢＳＡ的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2，以Ａ蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0。
　　以上操作中應注意，一切溶液中不應含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預處理。
　　
膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存
　　膠體金具有很高的動力學穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時自身凝聚極慢，可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。
　　金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。
　　當金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì)的等電點，如ConA，過氧化物酶等，當pH較低時保持穩(wěn)定，提高pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電點或略高時又變得穩(wěn)定了。標記后的膠體金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作為穩(wěn)定劑。在4～10℃貯存數(shù)月有效，不宜冰凍。貯存中可能會發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去。
免疫膠體金的應用
　?。?、膠體金在電鏡水平的應用
　　膠體金應用電鏡水平的研究最早，發(fā)展最快，應用最廣泛。其最大優(yōu)點是可以通過應用不同大小的顆?；蚪Y合酶標進行雙重或多重標記。直徑為3～15nm 膠體金均可用作電鏡水平的標記物。3～15nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測，而直徑15nm 多用于檢測量較多的感染細胞。
　　膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：①細胞懸液或單層培養(yǎng)中細胞表面抗原的觀察。②單層培養(yǎng)中細胞內(nèi)抗原的檢測。③組織抗原的檢測。
　　金標記在電鏡水平的應用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫負染色、雙標記技術和原位雜交技術等。
　　實驗證明，該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、操作簡單、敏感性和特異性高，既可用于抗原檢測，也可用于抗體檢測，因此，可同時適用于科研和診斷。
　　２、膠體金在光鏡水平的應用
　　膠體金同樣可用做光鏡水平的標記物，取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細胞涂片、切片均可應用。主要用于：①用單克窿抗體或抗血清檢測細胞懸液或培養(yǎng)的單層細胞的膜表面抗原。②檢測培養(yǎng)的單層細胞胞內(nèi)抗原，③組織中或亞薄切片中抗原的檢測。
　　膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補其它標記物不可避免的本底過高和內(nèi)部酶活性干擾等缺點。
　　３、膠體金在流式細胞儀中的應用：
　　應用熒光素標記的抗體，通過流式細胞儀計數(shù)分析細胞表面抗原，是免疫學研究中的重要技術之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊，區(qū)分不同的標記困難，因此必須尋找一種非熒光素標記物，用于流式細胞計數(shù)。這樣可以同時進行幾種標記。該標記物必須能夠改變散射角，膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，因而可以作為流式細胞儀的標記物之一。
　?。础⒛囼灒簡畏稚⒌拿庖呓鹑苣z呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當與相應抗原或抗體發(fā)生專一性反應后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，顆粒也會沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無色，這一原理可定性或定量地應用于免疫反應。
　?。?、免疫印跡技術(immunoblotting)：免疫印跡是一種較新的免疫化學技術。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后用酶免疫法（或免疫熒光、ＲＩＡ）進行定量。
　　免疫膠體金也可用于該法的定量。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后，再與經(jīng)葡萄球菌Ａ蛋白致敏的膠體金溫育，徹底洗去多余的膠體金，根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。
　　利用金顆?？纱呋y離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強金顆粒的可見性，更可大大提高測定靈敏度，檢測下限可低至 0.1ng，這種免疫金銀染色法應用已日趨廣泛。
　　由于膠體金免疫印跡技術簡便、快速，且有相當?shù)母叩撵`敏度，在臨床免疫診斷上有很大的應用潛力。
　　６、膠體金在肉眼水平的應用
　　膠體金取代傳統(tǒng)三大標記物，用于肉眼水平的免疫檢測中。除了膠體金本身具有的特點外，還有以下優(yōu)點：①試劑和樣本用量極小，樣本量可低至1～2ul；②不需γ－計數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標檢測儀等貴重儀器，更適于現(xiàn)場應用； ③沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與；④實驗結果可以長期保存；⑤時間大大縮短，提高了檢測速度。金標過程中，無共價鍵形成，是一定離子濃度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標記，標記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。實驗結果表明，膠體金的敏感性可達到 ELISA的水平。而結合銀染色時，檢測的敏感性更大大提高。
　　　
膠體金在免疫層析快速診斷技術中的應用
　　
　　免疫層析法(immunochromatography)是近幾年來國外興起的一種快速診斷技術，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。
　　早孕診斷用的免疫層析試紙條（通常又叫尿妊紙條）的裝配結構見圖一。
　　裝配方法：在塑料底板上分別將吸尿用玻璃纖維、凍干金標記抗α－HCG玻璃纖維、已固定有抗β－HCG抗體的NC膜及硬質(zhì)吸水濾紙按圖裝配，配件與塑料底板的結合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為4mm的條狀，即為尿妊用紙條。
　　本法檢測速度快，一般一兩分鐘可出結果；靈敏度高，可達50IU/L；好的試紙條結果也是準確可靠的，這是其所以能在尿妊診斷中得到廣泛應用的主要原因。尿妊試紙條的快速特性來源于膠體金免疫層析法的固有特性，但與原材料選擇特別是NC膜的孔徑大小密切相關，準確性取決于抗β－HCG的特異性。
　　金標尿妊紙條雖然好用，但在使用中也必須注意以下幾個方面：一是溫度，試紙條雖然可在室溫保存，但大批暫時不用的試紙條還是應該放在４℃保存，以免抗體失效，從冰箱剛?cè)〕龅脑嚰垪l則應待其恢復至室溫，然后才打開密封，可避免反應線模糊不清。二是正確操作，一般的操作方法是在試紙條的吸尿玻璃端滴入２滴（約１００微升）尿液，或?qū)⑽蚨酥苯硬迦霕吮局?，深度約１０～１５毫米２０秒，取出后平放，這種方法比較麻煩且容易造成污染。我們的方法是取尿標本約0.5ml 加入小試管中，然后插入試紙條，待１～２分鐘反應帶清晰后觀察結果。
　　
膠體金在快速斑點滲濾技術中的應用
　　ＥＬＩＳＡ法在臨床實驗室已得到普遍的應用，特別是用于各型肝炎標志物的檢測。但ＥＬＩＳＡ法由于操作程序復雜，時間較長，給實驗室?guī)聿槐?。因此出現(xiàn)一步法快速檢測試劑盒，雖可提高檢測速度，但有出現(xiàn)假陰性結果的弊端。ＥＬＩＳＡ法需時較長的主要原因，是由于液相中的抗原（或抗體）需經(jīng)擴散才能與固相上的抗原或抗體反應不適當?shù)乜s短反應時間，將使靈敏度降至臨床要求以下。為滿足臨床快速檢測的需要，近年來發(fā)展了多種簡便、快速的免疫學檢測方法，快速斑點滲濾法即為其中一種，其標記物質(zhì)用膠體金即稱為快速斑點免疫金滲濾法Dot-immunogold filtration assay)，又稱滴金免疫法。
　　快速斑點滲濾法的基本原理仍是間接法或夾心法。間接法測抗體：固定于膜上的特異性抗原＋標本中的相應抗體＋金標記的抗抗體或ＳＰＡ顯色。夾心法測抗原：固定于膜上的多克隆抗體＋標本中待測抗原＋金標記的特異性單克隆抗體顯色。
結果判斷：快速斑點免疫金滲濾法在操作完成后即可直接觀察結果。根據(jù)測定模式的不同可有以下不同的判定結果。
快速斑點免疫金滲濾法檢測速度快，結果觀察一目了然，已應用于多種臨床檢測項目。
　　以上分析可以看出，膠體金標記技術是繼三大標記技術之后，又一較為成熟且已得到廣泛應用的免疫標記技術。

摘自下列網(wǎng)站：

http://www./index.asp

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