HBV感染可引起慢性乙型肝炎（CHB）、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌等終末期肝病，嚴(yán)重威脅著人類健康。HBV 感染呈世界性流行，全球約有 2.4 億慢性HBV感染者。在我國(guó)，預(yù)防性乙型肝炎疫苗的廣泛接種使新發(fā)感染率明顯下降，然而我國(guó)仍然是 HBV 感染的中高流行區(qū)。據(jù)推算，2016 年我國(guó)一般人群HBsAg陽(yáng)性率為6.1%（95%可信區(qū)間:5.5%~6.9%），HBsAg陽(yáng)性人群約 8600.7 萬(wàn)。

HBV 屬于嗜肝DNA病毒科，其通過(guò)HBsAg的 pre-S1 區(qū)與肝細(xì)胞膜上的受體-鈉離子/牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）結(jié)合進(jìn)入肝細(xì)胞。隨后，核衣殼在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)裂解并將部分雙鏈的松散環(huán)狀 DNA（rcDNA）釋放入細(xì)胞核內(nèi)，并通過(guò)宿主DNA聚合酶和拓?fù)涿傅刃扪a(bǔ)DNA 雙鏈缺口，形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。隨后，以 cccDNA 為模板，分別轉(zhuǎn)錄出 3.5 kb 的前基因組 RNA（pgRNA）和preC mRNA，以及 2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb 的 mRNA，轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯形成相應(yīng)蛋白。翻譯形成的P蛋白與 pgRNA 結(jié)合后招募core蛋白，并組裝成病毒核衣殼。pgRNA在核衣殼內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄形成HBV DNA負(fù)鏈，再以負(fù)鏈為模板合成HBV DNA正鏈，形成病毒核心顆粒。最終，病毒核心顆粒經(jīng)多囊泡小體包膜化并以病毒顆粒形式釋放至細(xì)胞外。此外，合成的含有rcDNA的病毒核心顆粒也可進(jìn)入細(xì)胞核補(bǔ)充 cccDNA 池，使得HBV cccDNA 在肝細(xì)胞核內(nèi)維持 5~50 拷貝/細(xì)胞。雖然 CHB 患者中 cccDNA 通常只占肝內(nèi) HBV DNA 總量的很少一部分，但其半衰期長(zhǎng)，可穩(wěn)定存在于肝細(xì)胞核內(nèi)，是 HBV 持續(xù)感染難以清除的重要原因。

目前臨床上治療CHB的抗病毒藥物為核苷（酸）類藥物（NAs） 和IFN。NAs 主要通過(guò)抑制P蛋白的逆轉(zhuǎn)錄活性，并與內(nèi)源性核苷競(jìng)爭(zhēng)性摻入病毒的 DNA 鏈，終止 DNA 鏈的延長(zhǎng)和合成，從而抑制病毒的復(fù)制。NAs 可有效抑制病毒復(fù)制并延緩疾病進(jìn)程，但由于其不直接作用于cccDNA，停藥后易復(fù)發(fā)，需要長(zhǎng)期用藥，進(jìn)而存在依從性、耐藥，以及經(jīng)濟(jì)和心理壓力等一系列問(wèn)題。IFN 具有免疫調(diào)節(jié)作用和抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄的雙重作用，但由于其存在一定的副作用，療程有限，仍難以徹底清除HBV。由此可見(jiàn)，目前的抗病毒治療很難實(shí)現(xiàn)CHB的臨床治愈。究其原因，cccDNA的持續(xù)存在是CHB患者接受抗病毒治療后難以實(shí)現(xiàn)臨床治愈的重要因素。因此，研發(fā)靶向HBV cccDNA的藥物至關(guān)重要。本文將針對(duì)靶向HBV cccDNA的藥物和生物技術(shù)的研究進(jìn)展作一綜述。

1  靶向cccDNA的基因編輯技術(shù)

目前，靶向cccDNA的常用基因編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)（Cas）蛋白9 （CRISPR/Cas9）技術(shù)。

1.1  靶向cccDNA的ZFN技術(shù)

2010年，Cradick等首次證實(shí)ZFN可靶向切割HBV DNA基因組，使HBV pgRNA水平降低29％。2014年，Weber等針對(duì)HBV基因組P、C和X區(qū)開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)了3個(gè)ZFN，并利用腺相關(guān)病毒載體遞呈HBV特異性ZFN，測(cè)試其在HepAD38細(xì)胞中的抗HBV活性。結(jié)果表明，ZFN通過(guò)誘導(dǎo)靶位點(diǎn)堿基突變有效地破壞HBV基因組，其中腺相關(guān)病毒遞送的靶向P區(qū)開(kāi)放閱讀框的ZFN可高效抑制HepAD38細(xì)胞中HBV復(fù)制，并持續(xù)至少2周。上述通過(guò)ZFN技術(shù)靶向破壞HBV基因組的研究證實(shí)了將基因編輯技術(shù)應(yīng)用于抗病毒治療的可能性。

1.2  靶向cccDNA的TALEN技術(shù)

Bloom等設(shè)計(jì)了針對(duì)HBV基因組的TALEN，并證實(shí)TALEN可誘導(dǎo)cccDNA靶位點(diǎn)發(fā)生突變，首次證明了TALEN技術(shù)通過(guò)破壞HBV cccDNA有效抑制HBV復(fù)制。2014年，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將TALEN與DNA同源重組技術(shù)相結(jié)合，其首先通過(guò)靶向HBV基因組的TALEN切割HBV DNA，隨后，將人工設(shè)計(jì)的靶向HBV的初級(jí)microRNA(pri-miR)序列作為供體序列，通過(guò)DNA同源重組整合至病毒基因組中。一方面，該pri-miR序列能在病毒啟動(dòng)子的作用下轉(zhuǎn)錄形成靶向HBV的miRNA從而抑制病毒復(fù)制，另一方面，由于插入pri-miR序列導(dǎo)致的錯(cuò)義突變將進(jìn)一步破壞病毒基因，進(jìn)而協(xié)同抑制HBV復(fù)制。TALEN技術(shù)的應(yīng)用為基因編輯技術(shù)通過(guò)靶向破壞HBV cccDNA抑制病毒復(fù)制提供了新的思路。

1.3  靶向cccDNA的CRISPR技術(shù)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過(guò)單鏈導(dǎo)向RNA（gRNA）和Cas9蛋白指導(dǎo)基因編輯。與ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)及操作更為簡(jiǎn)單，這使其得到了廣泛的應(yīng)用。2014年，Lin等設(shè)計(jì)了8條靶向HBV的gRNA，并證實(shí)通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可靶向切割HBV基因組，并顯著抑制HBV復(fù)制。Wang等發(fā)現(xiàn)與單個(gè)gRNA相比，雙gRNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可通過(guò)去除切割位點(diǎn)之間的片段來(lái)更大程度地破壞HBV基因組，從而更為高效地抑制HBV復(fù)制。2017年，Wang等進(jìn)一步通過(guò)gRNA-miR-HBV-gRNA 三聯(lián)表達(dá)框架將CRISPR/Cas9和RNAi技術(shù)整合，借助miRNA 在細(xì)胞內(nèi)的加工過(guò)程最終產(chǎn)生兩個(gè)靶向HBV的 gRNA和一個(gè)靶向HBV的miRNA（miR-HBV），二者協(xié)同降低細(xì)胞內(nèi) cccDNA 水平，促進(jìn)HBV清除。除了直接靶向cccDNA外，由于cccDNA的形成需要宿主因素的參與，還可通過(guò)靶向宿主基因從而影響cccDNA的合成。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，聚合酶κ是在新發(fā)HBV感染期間cccDNA形成所需的關(guān)鍵宿主因子。使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲減HepG2-NTCP細(xì)胞中聚合酶κ基因表達(dá)可顯著抑制rcDNA向cccDNA轉(zhuǎn)化，降低cccDNA水平。隨著CRISPR技術(shù)的發(fā)展和對(duì)HBV復(fù)制周期認(rèn)識(shí)的加深，具有更高編輯效率和更低脫靶率的CRISPR系統(tǒng)也有望用于抗病毒研究與治療中。除了上述3種常見(jiàn)的基因編輯工具外，另有報(bào)道稱在體外使用靶向HBV cccDNA的ARC核酸酶可顯著破壞cccDNA和整合到人體肝細(xì)胞中的HBV DNA。

（詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參考網(wǎng)址http:///gilead-sciences-and-precision-biosciences-announce-collaboration-to-develop-therapies-against-hepatitis-b-virus-using-arcus-genome-editing/）

然而，目前基因編輯技術(shù)潛在的脫靶效應(yīng)以及缺乏合適的體內(nèi)遞呈載體限制了其在臨床上的使用，通過(guò)基因編輯技術(shù)靶向cccDNA仍有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與優(yōu)化。

2  表觀遺傳學(xué)修飾靶向靜默cccDNA

表觀遺傳學(xué)修飾，即DNA甲基化和組蛋白修飾等。多項(xiàng)研究已證實(shí)表觀遺傳學(xué)修飾可調(diào)控HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響HBV復(fù)制。

2.1  靶向 cccDNA的DNA甲基化修飾

HBV基因組包含3個(gè)主要的CpG島，并且cccDNA的微染色體結(jié)構(gòu)受DNA甲基化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。Zhang等分析了cccDNA中CpG島甲基化的分布，并研究了CpG島甲基化對(duì)病毒復(fù)制的影響，結(jié)果表明CpG島Ⅱ的甲基化可顯著降低cccDNA的轉(zhuǎn)錄水平，提示改變HBV cccDNA的甲基化狀態(tài)可作為一種潛在的實(shí)現(xiàn)功能性治愈的手段。

2.2  靶向cccDNA的組蛋白修飾

2006年，Pollicino等發(fā)現(xiàn)與cccDNA結(jié)合的H3/H4組蛋白乙酰化狀態(tài)可調(diào)節(jié)HBV復(fù)制。組蛋白去乙?；?可募集到cccDNA上導(dǎo)致組蛋白去乙?；?，并抑制HBV復(fù)制。I類組蛋白去乙?；敢种苿┛缮险{(diào)H4組蛋白乙酰化，并促進(jìn)HBV復(fù)制。Liu等發(fā)現(xiàn)IFNα可通過(guò)降低H3組蛋白賴氨酸(H3K）9和H3K27的乙?；揭种芻ccDNA轉(zhuǎn)錄。Zhang等發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5可通過(guò)促進(jìn)cccDNA上H4組蛋白精氨酸3的對(duì)稱二甲基化抑制HBV core蛋白和基于Brg1的人SWI/SNF染色質(zhì)重塑體的相互作用，進(jìn)而抑制RNA聚合酶Ⅱ與cccDNA的結(jié)合。由此可見(jiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)cccDNA結(jié)合組蛋白乙?；富蛉ヒ阴；傅幕钚?，可作為抗HBV治療的靶點(diǎn)。

以上多項(xiàng)研究證實(shí)表觀遺傳學(xué)修飾對(duì) HBV 的持續(xù)存在和清除起著重要作用，表明表觀遺傳治療具有治療CHB的潛力。此外，可以通過(guò)借鑒腫瘤和其他病毒性疾病的表觀遺傳治療，為CHB的治療開(kāi)辟新途徑。

3  細(xì)胞因子靶向清除cccDNA

除了治療性疫苗之外，許多細(xì)胞因子可參與HBV感染的控制。Lucifora等發(fā)現(xiàn)高劑量IFNα處理能刺激APOBEC3A的表達(dá)，淋巴毒素β受體激活能刺激APOBEC3B的表達(dá)，二者可通過(guò)HBV core蛋白與cccDNA相互作用，導(dǎo)致胞苷脫氨基，脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)形成，從而導(dǎo)致cccDNA降解。Xia等發(fā)現(xiàn)IFNγ和TNFα能各自誘導(dǎo)cccDNA脫氨基并干擾其穩(wěn)定性，并證實(shí)HBV特異性T淋巴細(xì)胞不需要細(xì)胞溶解所需的直接接觸，而是通過(guò)分泌IFNγ和TNFα亦可抑制HBV復(fù)制并降低感染細(xì)胞中cccDNA水平。Bockmann等研究發(fā)現(xiàn)IFNβ和IFNλ能使肝細(xì)胞中HBV cccDNA通過(guò)脫氨基作用發(fā)生G-A序列改變。并且與IFNα相比，IFNβ和IFNλ誘導(dǎo)的APOBEC脫氨酶表達(dá)更為持久。Qiao等在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)TGFβ可通過(guò)肝細(xì)胞中激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶誘導(dǎo)cccDNA脫氨基降解和突變。然而，有關(guān)細(xì)胞因子針對(duì)HBV cccDNA的抗病毒作用還有待進(jìn)一步的研究。

4  靶向病毒蛋白負(fù)性調(diào)控cccDNA

病毒蛋白包括HBV X蛋白（HBx）和core蛋白在cccDNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程和維持cccDNA的穩(wěn)定性中都發(fā)揮著重要作用。因此，除了直接靶向HBV cccDNA外，通過(guò)靶向這些病毒蛋白也能實(shí)現(xiàn)對(duì)cccDNA的調(diào)控。

4.1  靶向HBx抑制cccDNA 轉(zhuǎn)錄

HBx能通過(guò)與宿主的損傷特異性DNA結(jié)合蛋白1（DDB1）結(jié)合從促進(jìn)HBV復(fù)制。Decorsière等發(fā)現(xiàn)HBx通過(guò)降解染色體結(jié)構(gòu)維持（Smc）復(fù)合物Smc5/6可緩解Smc5/6對(duì)HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用。Murphy等進(jìn)一步證明HBx與DDB1-CUL4-ROC1（CRL4）E3連接酶相互作用，泛素化降解Smc5/6，進(jìn)而促進(jìn)HBV復(fù)制?；诖耍琒ekiba等發(fā)現(xiàn)一種噻唑化物抗感染劑硝唑尼特可有效抑制HBx-DDB1蛋白的相互作用，并在人原代肝細(xì)胞中證實(shí)硝唑尼特能夠恢復(fù)Smc5蛋白水平，進(jìn)而抑制HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄和病毒蛋白產(chǎn)生。

4.2  靶向core蛋白干擾cccDNA合成

NAs雖然并不直接作用于cccDNA，但卻通過(guò)抑制以前基因組RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成rcDNA的過(guò)程，阻斷cccDNA的補(bǔ)充，因而被認(rèn)為具有間接耗竭cccDNA的作用。然而，現(xiàn)有NAs并不能夠完全阻斷新rcDNA的合成。核衣殼裝配調(diào)節(jié)劑（CpAM）能變構(gòu)調(diào)節(jié)core蛋白結(jié)構(gòu)并隨后改變core蛋白組裝的動(dòng)力學(xué)和途徑，導(dǎo)致形成不規(guī)則形狀的core蛋白聚集體或缺乏pgRNA和P蛋白的空衣殼。除了抑制核衣殼組裝和隨后的病毒基因組復(fù)制之外，CpAM還能改變核衣殼的結(jié)構(gòu)和功能，并因此影響病毒DNA復(fù)制和（或）cccDNA補(bǔ)充。CpAM能誘導(dǎo)病毒粒子以及含有雙鏈DNA的核心顆粒發(fā)生解體，從而在新發(fā)感染和細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增過(guò)程中干擾cccDNA生物合成途徑。了解core蛋白質(zhì)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對(duì)核衣殼裝配和拆卸的雙重作用所依據(jù)的分子機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)新的靶向core蛋白的抗病毒藥物，進(jìn)而更加有效地抑制cccDNA合成和治療CHB。CpAM作為一種針對(duì)新靶點(diǎn)的抗病毒藥物，未來(lái)有望聯(lián)合其他抗病毒藥物共同清除HBV。

總之，現(xiàn)階段有多個(gè)靶向 HBV 生命周期各個(gè)階段的新型抗病毒藥物正在研發(fā)之中，其中靶向HBV cccDNA的治療策略被認(rèn)為是最有可能清除 HBV 的手段，故被認(rèn)為是HBV 新藥發(fā)展的重要方向。此外，結(jié)合免疫治療的多途徑、多靶點(diǎn)藥物聯(lián)合阻斷 HBV 的生物學(xué)合成并促進(jìn)cccDNA清除將可能成為根治慢性 HBV 感染的重要途徑。但目前對(duì) cccDNA 形成、維持及降解的生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明，相關(guān)基礎(chǔ)研究亟需加強(qiáng)。