非洲豬瘟

非洲豬瘟ASF）：是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性、致死性動物傳染病。ASFV主要感染各品種的家豬、非洲和歐亞野豬、鈍緣蜱等，其中疣豬和灌木豬均可被感染，但不表現(xiàn)臨床癥狀，疣豬等非洲野豬和鈍緣蜱為ASFV的宿主。根據(jù)ASFV的毒力，ASF的臨床癥狀和感染過程有顯著差異，最急性和急性型感染死亡率為100％。在感染高致病力ASFV毒株后，臨床癥狀主要表現(xiàn)為高燒、嚴(yán)重抑郁、厭食、皮膚發(fā)紺、出血性病變等。ASFV是世界養(yǎng)豬業(yè)急需要解決的重要問題，研究人員盡管評估了由天然存在、細(xì)胞培養(yǎng)減毒或基因修飾的ASFV產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)疫苗，但目前仍未能研制出具有高免疫原性和完全保護(hù)效果的疫苗，ASFV疫苗開發(fā)將繼續(xù)成為未來幾年研究的熱點(diǎn)。

我國是生豬產(chǎn)銷大國，豬肉消費(fèi)量占世界豬肉消費(fèi)量的50%，生豬養(yǎng)殖區(qū)域遍及全國。根據(jù)《中國統(tǒng)計(jì)年鑒2018》發(fā)布的最新修訂數(shù)據(jù)，我國生豬存欄量達(dá)到44158.92萬頭，養(yǎng)豬數(shù)量居世界前列。但目前我國養(yǎng)豬生產(chǎn)水平和生物安全控制程度不一，存在散養(yǎng)戶、中小養(yǎng)殖場、大型養(yǎng)殖場等多種生產(chǎn)主體。我國現(xiàn)有2600萬個養(yǎng)豬場戶，雖然規(guī)?；B(yǎng)殖的比例逐年加大，但年出欄500頭以上的占不到1%，散養(yǎng)戶仍將長期存在，生物安全風(fēng)險(xiǎn)較高。另外，我國野豬和軟蜱的分布廣泛，極易形成ASFV自然疫源地。在上述情況下，我國ASF的防控和凈化工作形勢非常嚴(yán)峻，迫切需要ASFV疫苗等疫病防控技術(shù)與產(chǎn)品。本文總結(jié)了國內(nèi)外ASFV免疫學(xué)和疫苗研究現(xiàn)狀，以期對非洲豬瘟疫苗的開發(fā)起到借鑒作用。

1 ASFV免疫學(xué)研究

1.1 ASFV概述

ASFV是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）的唯一成員，是目前已知的唯一具有DNA基因組的蟲媒病毒。病毒基因組為線性、共價(jià)封閉的雙鏈DNA（dsDNA）分子。不同地區(qū)ASFV分離株基因組的特異性不同，長度也存在差異，不同分離株的長度大約為170～190kb。ASFV含有151～167個開放性閱讀框（ORFs），成熟的病毒粒子中約含有50種以上結(jié)構(gòu)蛋白。Alejo A通過ASFV蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出68種病毒蛋白，包括兩種新鑒定的結(jié)構(gòu)蛋白p5和p8，它們分別來自核心多聚蛋白pp220和pp62。此外，還有涉及DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)修飾的各種酶，以及與病毒入侵和逃避宿主防御有關(guān)的蛋白。ASFV病毒粒子呈二十面體形態(tài)，直徑約為200nm，具有內(nèi)膜和囊膜雙層膜結(jié)構(gòu)，病毒于胞漿內(nèi)復(fù)制。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ASFV在易感宿主（野豬）和兩種非易感物種（人和綠猴）的三種易感哺乳動物細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)譜顯著不同。比較基因組學(xué)揭示了ASFV病毒基因庫在有限樣本中具有高度多樣性。ASFV基因組差異的地域特征為病原的傳播溯源提供了理論依據(jù)。根據(jù)P72基因序列特點(diǎn)，可將ASFV分為24個基因型。其中，22個基因型系從東非、南非的家豬或野生動物（包括野豬、散養(yǎng)豬及軟蜱）體內(nèi)分離獲得；第23個基因型系從東非埃塞俄比亞分離獲得，而且分析發(fā)現(xiàn)B602L基因中央可變區(qū)氨基酸序列不同，含有新的四聚體重復(fù)。QuemboCJ使用部分B646L基因（p72）和B602L基因的中心可變區(qū)（CVR）組合測序，對19個軟蜱病毒分離株進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)5個分離株構(gòu)成一種新的未鑒定的基因型，命名為基因型XXIV。目前我國發(fā)生的ASFV毒株是基因II型，ASFV China/2018/AnhuiXCGQ株與其他基因II型毒株的基因組比較發(fā)現(xiàn)，該毒株存在54-107個變異位點(diǎn)，會引起10-38基因中氨基酸殘基的變化，與POL/2015/Podlaskie株的同源性最高。

1.2主要蛋白與功能

ASFV病毒粒子由中心類核、核殼、內(nèi)包膜和二十面體衣殼組成，病毒通過細(xì)胞質(zhì)膜出芽獲得外包膜。病毒粒子結(jié)構(gòu)的主要成分由50多種病毒編碼蛋白質(zhì)構(gòu)成，包括結(jié)構(gòu)蛋白、基因轉(zhuǎn)錄和RNA加工所需的酶。主要有衣殼蛋白p72（B646L），多聚蛋白p220（CP2474L）和p62（CP530R），DNA結(jié)合蛋白p10（K78R）和PA104R，膜蛋白p12（O61R）、p17（D117L）、p22（KP177R）、p54（E183L）、PE248R、PE199L和PEP402R，磷蛋白p30（CP204L）和P14（E120R），細(xì)胞凋亡抑制因子IAP（A224L），半胱氨酸蛋白酶（S273R），絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（R298L）和DNA聚合酶X（O174L）等。另外，在ASFV病毒顆粒中可重復(fù)檢測到21種宿主蛋白，許多定位蛋白于細(xì)胞表面并與皮質(zhì)肌動蛋白細(xì)胞骨架相關(guān)。

構(gòu)成ASFV病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白有p72、p54、p30、pp220、pp62、CD2v等。其中，p72蛋白具有良好的反應(yīng)原性和抗原性，表達(dá)于ASFV感染晚期，是構(gòu)成病毒衣殼的重要成分。膜蛋白p54位于病毒顆粒類脂外膜上，氨基末端含有跨膜區(qū)域，對于周圍內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜的募集和轉(zhuǎn)化進(jìn)入病毒包膜的前體至關(guān)重要。p54蛋白與8kDa輕鏈細(xì)胞質(zhì)動力蛋白（DLC8）發(fā)生特異性相互作用，在ASFV感染早期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這是ASF發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。p30蛋白在病毒感染的早期進(jìn)行表達(dá)，具有比較好的抗原性，常被用于ASFV感染的早期檢測。研究發(fā)現(xiàn)，針對p30蛋白產(chǎn)生的抗體能夠阻礙生物大分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程，說明p30蛋白對病毒進(jìn)入細(xì)胞起到重要的作用。ASFV基因表達(dá)的最顯著特征之一是使用兩種多聚蛋白pp220和pp62來產(chǎn)生幾種結(jié)構(gòu)蛋白，約占病毒蛋白質(zhì)總量的32%。多聚蛋白pp62的表達(dá)對多聚蛋白pp220的亞細(xì)胞定位具有深遠(yuǎn)的影響，而且pp62對于病毒顆粒核心的正確組裝和成熟是必需的，它的抑制會減少病毒粒子的成熟。CD2v蛋白影響ASFV在家豬間的傳播，該蛋白與T細(xì)胞表面黏附因子CD2具有相似性。研究發(fā)現(xiàn)CD2v/C型凝集素蛋白介導(dǎo)ASFV的HAI血清學(xué)特異性，CD2v/C型凝集素特征測序提供了一種對ASFV血清型分組的簡化方法，CD2v/C型凝集素基因分型將促進(jìn)ASFV毒株多樣性和抗原變異性的研究，而且CD2v和C型凝集素蛋白是ASFV重要的保護(hù)性抗原，有助于疫苗的設(shè)計(jì)和開發(fā)。

1.3感染與免疫機(jī)制

ASFV的復(fù)制周期包括病毒附著、內(nèi)化、基因組增殖、子代病毒的裝配和釋放。細(xì)胞核是早期病毒DNA合成位點(diǎn)，病毒基因組復(fù)制起點(diǎn)與一些核蛋白重新分布位點(diǎn)提示存在復(fù)雜的機(jī)制來調(diào)節(jié)病毒的核感染機(jī)制。單核-巨噬細(xì)胞是ASFV感染的主要靶細(xì)胞。Sánchez EG研究表明阿米洛利是一種有效的巨噬細(xì)胞增多癥抑制劑，它的作用使ASFV侵染效果顯著降低。病毒主要通過肌動蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用與巨胞飲作用進(jìn)入巨噬細(xì)胞，隨后病毒內(nèi)層囊膜與次級內(nèi)體融合，病毒核心被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。病毒表達(dá)自身DNA聚合酶、連接酶和核酸內(nèi)切酶等保證復(fù)制的準(zhǔn)確性。Mottola C等發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類可通過靶向II型拓?fù)洚悩?gòu)酶顯示出干擾ASFV復(fù)制周期，核苷類似物可通過摻入病毒核酸或干擾其必需酶如聚合酶和核糖核苷酸還原酶來抑制病毒復(fù)制。Barrado-GilL等研究表明，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是非洲豬瘟復(fù)制所必需的物質(zhì)，其可以發(fā)揮調(diào)節(jié)作用細(xì)胞信號傳導(dǎo)中的作用。Frouco G等（2017）研究表明苯丁酸鈉通過破壞病毒誘導(dǎo)的組蛋白H3K9_K14低乙?；癄顟B(tài)，抑制非洲豬瘟病毒的復(fù)制，具備良好的抗病毒活性。Chen Y等用X-射線晶體學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)了四種AsfvLIG：DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并證明AsfvLIG具有獨(dú)特的N-末端結(jié)構(gòu)域（NTD），其在底物結(jié)合和催化復(fù)合物裝配中起關(guān)鍵作用，為針對DNA修復(fù)通路蛋白設(shè)計(jì)ASFV藥物提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。GalindoI等研究發(fā)現(xiàn)伊曲康唑（ITZ）和25-羥基膽固醇（25-HC）顯著降低了AS?FV細(xì)胞適應(yīng)毒株BA71V在Vero細(xì)胞中的復(fù)制，該研究揭示了氧固醇結(jié)合蛋白（OSBP）在未感染Vero細(xì)胞和受感染細(xì)胞中病毒工廠（VF）外周細(xì)胞質(zhì)膜的分布，在ASFV感染下，OSBP和OSBP相關(guān)蛋白、PI4Kβ和ACBD3被募集到VF中。Freitas FB等利用siRNA檢測揭示了超家族RNA解旋酶IIQP509L和Q706L在ASFV病毒周期中的相關(guān)作用，特別是對于晚期轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制，結(jié)果表明兩種解旋酶在病毒感染期間都是必需的，可針對其開發(fā)非洲豬瘟的藥物和疫苗。

ASFV編碼多種免疫逃逸蛋白，通過抑制干擾素產(chǎn)生、抑制細(xì)胞凋亡和自噬等機(jī)制調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答。如A238L和DP71L蛋白調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，可抑制宿主細(xì)胞關(guān)閉表達(dá)系統(tǒng)與抑制NAFT等轉(zhuǎn)錄因子的激活；多基因家族蛋白MGF360、MGF505/530和I329L等可抑制誘導(dǎo)表達(dá)I型IFN介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)；p54、DP71L、A179L、A224L等可調(diào)控感染初期與后期的細(xì)胞凋亡；A179L可抑制細(xì)胞自噬；CD2v可抑制淋巴細(xì)胞增殖、與細(xì)胞AP-1蛋白互作并參與病毒細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)；L83L可抑制IL-1β的抗病毒效應(yīng)等。這些免疫逃逸蛋白以調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)、干擾宿主天然免疫系統(tǒng)和調(diào)控細(xì)胞周期等方式，來抑制和逃避宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，為自身增殖、擴(kuò)散創(chuàng)造有利條件。WangX等研究發(fā)現(xiàn)，ASFVChina/2018/1的DP96R通過抑制TBK1和IKKβ來負(fù)調(diào)節(jié)I型IFN表達(dá)和NF-κB信號傳導(dǎo)，后者在病毒免疫逃逸中起重要作用。

ASFV感染通常導(dǎo)致家豬的死亡率接近100％，但豬可在較低毒力ASFV分離株感染后存活，轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥?，并對同源或密切相關(guān)分離株的攻擊具有抵抗力，這表明豬產(chǎn)生了針對ASFV的保護(hù)性免疫。現(xiàn)有研究認(rèn)為細(xì)胞免疫和體液免疫在抗ASFV感染中都具有重要作用。ASFV的p72、CD2v、p12、p54、D117L和p30等蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，其中p72和p54可抑制病毒的吸附，p72和p30可激活CTL應(yīng)答，p30可抑制病毒的內(nèi)化，膜蛋白CD2v、p12、D117L參與抑制病毒的入侵和釋放。ASFV減毒分離株OUR/T88/3和E75CV1-4已被用于研究細(xì)胞和體液保護(hù)性免疫應(yīng)答，針對ASFV致死攻擊的保護(hù)與疫苗誘導(dǎo)的大量抗原特異性CD8（+）T細(xì)胞之間具有相關(guān)性，表明CD8（+）T細(xì)胞在對ASFV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，而且T細(xì)胞、CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞等也發(fā)揮相關(guān)作用。DeiGiudici S等通過分析感染ASFV變種后野豬和家豬的宿主細(xì)胞反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，與歷史毒株Nu81.2相比，用現(xiàn)代毒株22653/14感染后檢測到晚期p72蛋白的細(xì)胞內(nèi)水平更高；與豬巨噬細(xì)胞和野豬樣細(xì)胞相比，ASFV感染豬單核細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子水平更高。BurmakinaG等通過IFN-γELISpot測定和提取ASF免疫動物的PBMC，鑒定了存在于CD2v和C型凝集素上的六個離散T細(xì)胞表位區(qū)域，表明在ASFV感染和免疫情況下對這些蛋白的細(xì)胞反應(yīng)性，對ASFV保護(hù)性抗原、相關(guān)表位及其多樣性的解析將促進(jìn)ASFV亞單位疫苗的設(shè)計(jì)和開發(fā)。

2 ASFV疫苗研究

2.1 滅活疫苗

自20世紀(jì)60年代開始ASFV滅活疫苗的相關(guān)研究，包括疫苗抗原的培養(yǎng)方式（接種肺泡組織懸液、感染豬脾組織勻漿）、滅活方式（加熱、甲醛、甲苯、復(fù)方碘溶液、結(jié)晶紫、乙酰氮丙啶、β丙內(nèi)酯等理化學(xué)方法）、疫苗效果評價(jià)等。但前期研究表明，滅活疫苗不能產(chǎn)生針對ASFV強(qiáng)毒的有效保護(hù)，這可能是由于產(chǎn)生的ASFV特異性抗體并不具有中和活性。GomezPuertas P等研究證實(shí)，在細(xì)胞傳代過程中，低代次和高代次的ASFV毒株對中和抗體的敏感性存在差異，結(jié)果表明磷脂酰肌醇對于中和抗體的正確表位呈遞是必需的，而且病毒膜的脂質(zhì)組成對抗體蛋白質(zhì)識別具有重要作用。Blome S等研究表明，即使用新型佐劑PolygenTM或EmulsigenD等與ASFV（Armenia08株）滅活抗原進(jìn)行配伍，免疫動物能檢測到ASFV特異性抗體，但對ASFV強(qiáng)毒仍未起到保護(hù)作用，所有動物均發(fā)展為急性致死性ASF，而且疫苗接種動物的臨床過程略微加快，可能存在抗體依賴性增強(qiáng)。

2.2 減毒活疫苗

ASFV減毒活疫苗的研究主要采用分離鑒定天然致弱毒株、細(xì)胞（豬骨髓來源細(xì)胞、Vero細(xì)胞和COS-1細(xì)胞等）傳代致弱毒株、重組致弱毒株進(jìn)行?，F(xiàn)有研究證明，通過天然分離或基因重組的致弱毒株（OURT88/3或NH/P68）制備的減毒活疫苗，對同源非洲豬瘟病毒可產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，但對異源病毒保護(hù)率低或沒有保護(hù)，而細(xì)胞傳代致弱毒株抗原性發(fā)生改變不能產(chǎn)生免疫保護(hù)。但目前ASFV減毒活疫苗的安全問題有待于進(jìn)一步評估，天然致弱毒株免疫動物存在發(fā)熱、肺炎、關(guān)節(jié)腫脹、流產(chǎn)、死亡、慢性感染等諸多不良反應(yīng)，而且使用活疫苗需要配套可與野毒感染鑒別診斷的技術(shù)和產(chǎn)品，否則不利于ASFV的凈化。

ASFV對穩(wěn)定細(xì)胞系適應(yīng)后，會引起病毒基因組的大部分區(qū)域自發(fā)缺失，導(dǎo)致病毒毒力嚴(yán)重致弱，喪失對同源親本毒株攻擊的保護(hù)能力。KrugPW等利用ASFV-G株在Vero細(xì)胞中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，ASFV-G株在Vero細(xì)胞中的復(fù)制能力隨著傳代次數(shù)的增加而增強(qiáng)，同時在豬原代巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力下降，病毒毒力逐漸衰減，在傳至第110代時完全喪失，從而獲得致弱毒ASFV-G/V株，但是其抗原性發(fā)生改變，不能產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。

通過反向遺傳、基因編輯或同源重組等分子生物學(xué)技術(shù)，將ASFV的毒力基因或免疫抑制基因敲除，可降低ASFV的毒力并增強(qiáng)免疫應(yīng)答。如CD2v、TK、UK、MGF360/505、9GL、DP148R、NL等基因。MonteagudoPL等發(fā)現(xiàn)并證明了ASFVCD2v（EP402R）基因的缺失可顯著降低BA71株的毒力，基因缺失毒株BA71ΔCD2接種豬不僅對親本毒株BA71有保護(hù)作用，而且還可抵抗異源毒株E75（兩種均為基因型I）的攻擊，并發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)具有劑量依賴性，且在體內(nèi)觀察到的交叉保護(hù)與BA71ΔCD2在體外誘導(dǎo)能夠識別BA71和E75病毒的特異性CD8（+）T細(xì)胞的能力相關(guān)。Gallardo C等通過使用反向遺傳的方法，以ASFV/NH/P68天然弱毒株為骨架，分別構(gòu)建了A238L、A224L、EP153R、A276R缺失株，免疫保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺失株和ASFV/NH/P68株和缺失株免疫后的豬能夠抵抗基因I型ASFV/L60株的攻擊，但缺失株未能防御基因II型ASFV/Arm07株的攻擊（除了用NH/P68DA224L免疫的一只豬），而豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）中培養(yǎng)的親本病毒NH/P68株免疫的豬完全抵御Arm07株的攻擊。已有研究表明，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可高效構(gòu)建重組ASFV，并易于重組病毒的純化。BorcaMV等利用CRISPR/Cas9有效構(gòu)建了ASFV重組病毒，通過與同源重組方法對比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR/Cas9方法能夠顯著提升重組效率，并易于重組病毒的純化。因此，使用CRISPR技術(shù)編輯ASFV基因組已經(jīng)成為可能，也為研制非洲豬瘟基因缺失活疫苗提供了新的研究思路。

2.3 基因工程疫苗

ASFV可編碼多達(dá)150多種蛋白，選擇合適的抗原基因用于研究基因工程疫苗至關(guān)重要。目前，ASFV亞單位疫苗、核酸疫苗、活載體疫苗等基因工程疫苗的研究主要集中在p72、p30、p54、CD2v等抗原基因及其蛋白。

2.3.1 亞單位疫苗

利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞、293（HEK）細(xì)胞等蛋白重組表達(dá)系統(tǒng)，高效表達(dá)ASFV的保護(hù)性抗原蛋白或多肽，配以新型疫苗佐劑制備疫苗，是亞單位疫苗研究的主要策略。BarderasMG等利用重組桿狀病毒表達(dá)獲得p54/30嵌合蛋白，用嵌合蛋白免疫的豬產(chǎn)生了中和抗體，并且用ASFV致病性毒株攻擊后存活，與對照豬相比，最大病毒血癥滴度減少了約2個對數(shù)，表明構(gòu)建的嵌合蛋白可用作血清學(xué)診斷試劑，并可用于進(jìn)一步的免疫學(xué)研究。Neilan JG等為了評估p30、p54和p72的病毒中和表位，用桿狀病毒表達(dá)致病性ASFVPr4株的p30、p54、p72和p22蛋白免疫豬，在免疫組動物中檢測到ASFV特異性中和抗體，但用104TCID50劑量的Pr4攻毒，免疫組和對照組的所有動物在7-10DPI之間死亡，表明針對上述蛋白的中和抗體不足以進(jìn)行抗體介導(dǎo)的保護(hù)。Ivanov V測試了基于ASFV完整核苷酸序列分析的46種合成肽的免疫原性，發(fā)現(xiàn)特異性合成肽接種顯著延遲了感染ASFV家豬的死亡。Lopera Madrid等使用反向疫苗學(xué)系統(tǒng)鑒定和選擇了5種ASFV抗原，分別用人胚腎293（HEK）細(xì)胞純化的抗原（p72、p54、p12）和改良痘苗病毒MVA載體抗原（p72、EP153R、CD2v）初免-加強(qiáng)免疫豬，結(jié)果證明ASFV亞單位抗原從哺乳動物細(xì)胞中純化或在MVA載體中表達(dá)是安全的，并且在豬的初免-加強(qiáng)免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生ASFV特異性抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。

2.3.2 核酸疫苗

現(xiàn)有研究證明了DNA免疫作為開發(fā)ASFV候選疫苗的潛力，證實(shí)了疫苗誘導(dǎo)的CD8（+）T細(xì)胞對ASFV反應(yīng)的重要性，而且針對ASFV有效疫苗的設(shè)計(jì)需要誘導(dǎo)覆蓋SLA異源豬群和中和抗體更廣泛的CTL應(yīng)答。ArgilaguetJ M設(shè)計(jì)了一種新的重組質(zhì)粒載體pCMV-UbsHAPQ，編碼與泛素融合的ASFV三種病毒決定簇（sHA、p54和p30），結(jié)果表明，用重組質(zhì)粒免疫后，在不存在抗體的情況下誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答，并保護(hù)部分免疫豬免受ASFV的致死攻擊。Lacasta A等的研究表明，編碼三種與泛素融合的ASFV抗原（p54、p30和血凝素細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域）的DNA疫苗具有保護(hù)作用，在沒有可檢測抗體的情況下，用表達(dá)文庫免疫的農(nóng)場豬產(chǎn)生了針對致病性ASFVE75株致死性攻擊60％的保護(hù)，并且存活與血液中存在大量血凝素特異性CD8（+）T細(xì)胞相關(guān)。

為進(jìn)一步篩選有效的非洲豬瘟新型疫苗，現(xiàn)有學(xué)者將ASFV重組蛋白與核酸疫苗組合免疫豬，以分析其誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。Pérez-Nú?ez等選擇ASFV重組蛋白（p15、p35、p32、p54、CD2v-E）和表達(dá)ASFV基因（EP402R、CP204L、B646L、CP312R）的pcDNA3.1的組合免疫豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD2v蛋白與pCDNA-CP312R組合免疫豬時，血清在體外中和病毒感染，減少約10％，而pcDNA-p72、pcDNA-p32、pcDNA-CD2v或cDNA-CP312R，不能中和或僅輕度中和ASFV感染；IFN-γELISpots檢測結(jié)果表明，用ASFV的DNA+蛋白組合免疫豬可激活細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。Sunwoo SY等用ASFV質(zhì)粒DNA（CD2v、p72、p32、+/-p17）和重組蛋白（p15、p35、p54、+/-p17）的混合物對豬進(jìn)行三次接種，結(jié)果不能抵抗ASFVArmenia2007株的攻擊，免疫豬雖然產(chǎn)生了抗原特異性抗體，但缺乏中和病毒的能力。

2.3.3 活載體疫苗

ASFV活載體疫苗的研究，目前主要選用腺病毒（Adenovirus）、痘病毒（Poxviuses）、偽狂犬病毒（Pseudorabies）、甲病毒（Alphavirus）等載體表達(dá)ASFV主要的抗原基因，以期誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和CTL應(yīng)答。Lokhandwala等評估了7種腺病毒載體新型ASFV抗原（A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L、K205R和A104R）的免疫原性，用重組腺病毒配制在佐劑中混合免疫商品豬，大多數(shù)免疫豬對混合物中的所有抗原都有強(qiáng)烈的IgG反應(yīng)，誘導(dǎo)的抗體通過IFA和蛋白質(zhì)印跡分析識別來自Georgia2007/1ASFV感染細(xì)胞的病毒蛋白，重組腺病毒混合物還誘導(dǎo)ASFV特異性IFN-γ分泌細(xì)胞。HübnerA等通過CRISPR/Cas9技術(shù)在偽狂犬病病毒載體中插入和表達(dá)了ASFV的開放閱讀框E199L、CP204（p30）和KP177R（p22），優(yōu)化的密碼子顯著增強(qiáng)了E199L的表達(dá)，并且嵌合CAG啟動子增加了轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)。Murgia MV使用甲病毒載體平臺，構(gòu)建了表達(dá)ASFVp30（RP-30）、p54（RP-54）和pHA-72（RP-sHA-p72）抗原的甲病毒屬RP，并測試其在Vero細(xì)胞中的表達(dá)和豬的免疫原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RP-30在Vero細(xì)胞中表達(dá)最高，在豬中最具免疫原性的，其次是RP-54和RP-sHA-p72。該研究通過用ASFV天然減毒株OURT88/3加強(qiáng)免疫RP-30接種的豬，結(jié)果表明用減毒活病毒加強(qiáng)的策略可以拓寬對ASFV表位的識別。但上述活載體疫苗研究未進(jìn)行靶動物的攻毒保護(hù)試驗(yàn)，抵御ASFV強(qiáng)毒攻擊的有效性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)語與展望

ASFV現(xiàn)已進(jìn)入我國，開發(fā)安全有效的動物疫苗、快速診斷試劑用于該病的防控和凈化，構(gòu)建嚴(yán)密的生物安全防控技術(shù)體系已迫在眉睫?；谝陨螦SFV分子免疫學(xué)和疫苗研究現(xiàn)狀的分析，利用天然分離或毒力基因敲除的ASFV致弱毒株開發(fā)減毒活疫苗前景較為樂觀，但安全性是影響ASFV弱毒活疫苗實(shí)際應(yīng)用的重要因素，需要綜合評價(jià)毒株的毒力返強(qiáng)、不良反應(yīng)、持續(xù)性感染等安全風(fēng)險(xiǎn)，并且需要開發(fā)適用于ASFV培養(yǎng)的細(xì)胞系用于疫苗抗原生產(chǎn)。基因工程疫苗在安全性、鑒別診斷等方面優(yōu)勢明顯，ASFV亞單位疫苗、核酸疫苗、活載體疫苗等基因工程疫苗的研究潛力較大，但由于ASFV基因組龐大和免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜，需要在充分解析ASFV主要蛋白結(jié)構(gòu)與功能、感染與免疫機(jī)制、主要免疫原的識別與疫苗靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行基因工程疫苗更為深入的研究，并全面評價(jià)其在靶動物上的有效性。我國現(xiàn)已啟動ASFV重大基礎(chǔ)科學(xué)問題、疫苗創(chuàng)制、檢測技術(shù)、流行病學(xué)、專用消毒劑和蟲媒防控等專項(xiàng)研究，將為我國非洲豬瘟防控工作提供重要科技支撐。

《建立三道防線，嚴(yán)防死守，阻擊非瘟！》