對于呼吸科醫(yī)生來說，據(jù)統(tǒng)計，約70%的感染性疾病患者因傳統(tǒng)檢測方法無法確定病原體信息，不能得到及時有效地救治，從而使病情惡化。因此，快速、準確的病原體檢測方法，對有效診斷和及時控制感染性疾病具有重要的意義 [34]?？偹苤?，臨床微生物實驗室的熒光定量PCＲ技術對疑似病毒進行篩查和確認都必須建立在已知病原體基因序列基礎上，而對于未知的病毒病原體則無法鑒定。而二代測序技術不僅可以發(fā)現(xiàn)己知病原體，而且可以發(fā)現(xiàn)完全未知的病原體，現(xiàn)代分子分型技術類型多種多樣，而其中在感染性疾病溯源和監(jiān)測中最常用的分子技術有多位點序列分型（MLST）、脈沖場凝膠電泳（PFGE） 和多位點串聯(lián)重復序列分析（MLVA）等，而新興起的高分辨力的 WGS 技術為感染性疾病的準確溯源和監(jiān)測提供了保障，還可以多項分子技術的聯(lián)合使用進行優(yōu)勢互補提高檢測的準確性。其中“PFGE”被譽為病原體分子分型的金標準[35]。而使用 ＷＧＳ技術可以追蹤 病原體的流行情況以及更加準確地確定病原體可能的來源［36］。從而有效地控制病原體的散播和流行。且隨著該技術的不斷發(fā)展，目前對于不明病原體的溯源與監(jiān)測能力越來越突出。

     對病原體進行監(jiān)測或鑒定主要是為了防范病原體的傳播和指導臨床診療。2010年英國一家醫(yī)院在爆發(fā)鮑曼不動桿菌后， Lewis T等[37]利用全基因組測序鑒定出分離株中的單核苷酸多態(tài)性，這是該技術在醫(yī)院獲得性感染中消除流行病學關聯(lián)最早的應用，隨后，WGS在醫(yī)院暴發(fā)的檢測與溯源方面的應用越來越多起來， Harris SR [38] 等利用高通量基因組學方法，提供了甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）的顯性菌株的流行病學和微進化的高分辨率視圖，ST239 在40年間的全球分布和種系發(fā)生，以及其在醫(yī)院環(huán)境中人與人之間傳播的潛力。該結果對感染控制具有重要意義，并為針對MRSA傳播的干預產(chǎn)生了寶貴的信息。2011年，美國國立衛(wèi)生研究院臨床中心爆發(fā)了碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，Snitkin ES[39]等綜合基因組測序技術和流行病學分析了肺炎克雷伯氏菌分離株，將爆發(fā)追蹤至單個患者的三次獨立傳播，通過對基因組數(shù)據(jù)與流行病學數(shù)據(jù)的分析， 追溯到了疫情發(fā)生的原因、闡明了傳播途徑，最終實施了早期的感染控制，控制了院內(nèi)傳播。沙特阿拉伯 Saeb 等［40］通過NGS技術結合生物信息學、系統(tǒng)發(fā)育和病原學分析報道了首例人感染溶血梭菌 ( Clostridium haemolyticum) 。他們證實了NGS 在臨床微生物病原體鑒定的應用，也證實了NGS技術對于更多微生物樣本的分析在公共數(shù)據(jù)庫中共享的重要性。

我國研究人員在2009年的這次新型H1N1流感爆發(fā)中，證實了二代測序平臺用于未知病毒檢測的重要作用，在事先沒有知識或使用遺傳信息的情況下在每個樣本中產(chǎn)生數(shù)百萬個有效讀數(shù)并產(chǎn)生了幾乎完整的核苷酸信息，確診了流感暴發(fā)的病原為新型H1N1和季節(jié)性H3N2流感病毒[41]， 2012年荷蘭研究人員利用二代測序技術454GS-FLX平臺，在1例沙特急性肺炎轉腎衰的死亡病例痰液中發(fā)現(xiàn)一種全新的中東呼吸綜合征冠狀病毒，［42］這些數(shù)據(jù)都表明了二代測序可以是診斷新發(fā)傳染病的有用工具，對于不明病原體有著很好的鑒定與溯源作用。越來越多的研究證實WGS有可能從分離物中快速提供大量信息，包括物種，菌株類型，抗生素抗性，毒力以及其他爆發(fā)和病例管理信息。對病原體的溯源與監(jiān)測方面表現(xiàn)出了較為明顯的優(yōu)越性。但目前對于個體患者的診斷和治療方面，考慮到成本問題，其應用還不太廣泛。而K?ser等人[43]、Young等人[44]、Sherry等人[45]、Walker等人[46]的相關研究對于NGS技術在監(jiān)測病原體爆發(fā)方面，也得出了與上述相似的結論。

重癥下呼吸道感染病原體通常不明確，當前臨床主要采用抗原/抗體免疫學方法、傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)等技術進行診斷，但這些方法多存在培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)陽性率低的問題。二代測序技術是新型DNA／RNA測序方法，該技術基于對核酸分子的檢測，敏感性高， 耗時短，不依賴于傳統(tǒng)的病原學培養(yǎng)，前期抗生素應用對檢測 影響小。在重癥患者中，肺炎的發(fā)展導致顯著的發(fā)病率和死亡率以及額外的醫(yī)療保健費用。準確，快速地鑒定肺部感染患者的微生物病原體可能會導致有針對性的抗菌治療，可能產(chǎn)生的副作用更少，成本更低。Toma I等[47]利用NGS技術，在來自疑似肺炎的插管患者的支氣管抽吸物進行測定，從與主要培養(yǎng)的病原體相同的屬中鑒定出顯著多樣的細菌物種，很好的詮釋了NGS可識別的細菌屬的數(shù)量始終高于通過標準微生物方法鑒定的數(shù)量。Thorburn F等[48]在一項研究中利用89個呼吸道樣本，將內(nèi)部NGS方法與已建立的內(nèi)部RT-PCR測試進行了比較。結果顯示與RT-PCR相比，NGS的敏感性和特異性均低于RT-PCR測試，但NGS為檢測到的病毒提供了更詳細的類型信息，包括相關病毒的亞型數(shù)據(jù)以及血清型數(shù)據(jù)。還有一些研究指出[49.50]，NGS不僅能夠產(chǎn)生實時診斷數(shù)據(jù)，還可以提供抗性測試和分型數(shù)據(jù)，這也可用于快速檢測新型亞型的出現(xiàn)或突出潛在的爆發(fā)。其中Petty T.J. [49]設計的生物信息學管道（ezVIR）可用于用于處理來自任何標準平臺的HTS數(shù)據(jù)，并同時評估已知人類病毒的整個范圍，提供易于解釋和定制的結果，該管道旨在使用包含11,000多個完整病毒基因組的全面手動策劃數(shù)據(jù)庫來識別病毒，而且，它自動為HTS中的非專業(yè)人員生成清晰簡明（可自定義）的結果表示。隨著二代測序技術的發(fā)展，將進一步減少處理和測序時間，NGS的測序方法最終將能夠為臨床醫(yī)生提供快速，精確，獨立于培養(yǎng)的細菌，真菌和病毒病原體鑒定及其抗菌敏感性特征。

白色念珠菌作為一種機會性真菌病原體，在機體免疫低下時時常會引發(fā)感染，除了可導致淺表感染外，它也可以在肺深部感染，腸道或甚至血液。Ｗｕ 等［51］從復旦大學附屬華山醫(yī)院 40位白假絲酵母菌感染的患者中分離出62株白假絲酵母 菌，通過MLST技術分析，結合住院史，指出該醫(yī)院患者感染白假絲酵母菌可能是由于白假絲酵母菌的院內(nèi)傳 播，他們證實了MLST是研究白色念珠菌流行病學和進化的有用工具。新型隱球菌病是一種常見伺機性霉菌感染癥，對于免疫低下人群?？芍虏?，而新生隱球菌幾乎全部經(jīng)肺入侵而感染人體，90%病損僅局限于肺部，而還有10%可經(jīng)血行傳播擴散至其他器官。

Firacative等[52]對122株加特隱球菌Ⅲ型進行ＭＬＳＴ分型，并對其中的６０株進行全基因組ＳＮＰ分析，將該病原菌 劃分成Ｂ和Ｃ兩種主要的血清型，二者不僅群體的起源地不同，且發(fā)現(xiàn)主要是毒性更強的血清型B分離株可致肺隱球菌病，Ｃ型加特隱球菌對唑類抗生素的敏感性要低于Ｂ型加特隱球菌。也證實了菌株分型對于指導有效治療以改善疾病結果的重要性。2011年，在一起耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌感染流行事件中，Snitkin等[53] 對患者身上分離到 的肺炎克雷伯菌進行進行全基因組測序，綜合基因組學和流行病學分析將爆發(fā)追蹤至單個患者的三次獨立傳播，最后發(fā)現(xiàn)這些菌株是醫(yī)院常見的 ST258 型耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，并確定了主要傳播者，推斷出了可能的傳播途徑，而且他們的研究表明，基因組和流行病學數(shù)據(jù)的整合可以產(chǎn)生可操作的見解，有助于控制醫(yī)院內(nèi)傳播。

多項分子分型技術聯(lián)合使用可以增強對菌株的分辨力，提高分析的準確性。2012年我國有研究者將脈沖場凝膠電泳（PFGE）和多位點序列分型（MLST）聯(lián)合，對我國南部7個地區(qū)19家醫(yī)院感染鮑曼不動桿菌的患者的樣本進行病原體監(jiān)測，鑒定出146種多重耐藥菌株（對超過7種藥物具有抗性），利用PFGE將其劃分為了15簇， 發(fā)現(xiàn)不同型別菌株的分布具有地區(qū)傾向性，又用MLST技術對主要細菌主要簇群進行分析，并分出11個ST型，其中ST208是普遍的，而CC92 簇的ST型鮑曼不動桿菌有更廣的 耐藥譜，研究結果還表明，華南地區(qū)的多重耐藥鮑曼不動桿菌與其他國家的其他廣泛菌株有著共同的起源[54]。在加拿大不列顛哥倫比亞省的一個中型社區(qū)，3年期間爆發(fā)了結核病。Gardy JL 等[55]使用全基因組測序和社會網(wǎng)絡分析對32個結核分枝桿菌爆發(fā)分離株和4個歷史分離株的完整基因組進行了測序。結果顯示結核分枝桿菌的兩個遺傳上不同的譜系具有相同的MIRU-VNTR基因型，表明兩個伴隨的爆發(fā)，并發(fā)現(xiàn)社會環(huán)境因素 - 最有可能可卡因的使用增加 - 引發(fā)了兩個現(xiàn)存的M系譜的同時擴張。由高風險社交網(wǎng)絡的主要成員維持的結核病。僅基因分型和接觸者追蹤并未捕捉到爆發(fā)的真實動態(tài)。

     對于肺部的感染性疾病，尤其是對于下呼吸道特殊病原體、未知病原體的感染，快速的了解病原體毒力概況對于預測疾病嚴重程度和轉歸，以及在疾病早期進行風險評估至關重要，快速的了解病原體的耐藥性對于指導抗菌藥物應用，提升治療效果更是具有重要價值。以血清學培養(yǎng)為主要代表的傳統(tǒng)檢測技術，均有其相關的局限性[ 56.57]，例如血清培養(yǎng)學一方面需取決于微生物生長時長，通常需要長達5天，另一方面培養(yǎng)結果常常由于經(jīng)驗性抗生素治療而產(chǎn)生假陰性結果。二代測序技術作為新型的DNA／RNA測序方法，隨著這項技術的不斷發(fā)展與研究，其不僅能夠同時檢測細菌、真菌、病毒、寄生蟲等各類病原體， 特異性高，同時還可以檢出毒力基因、耐藥基因的信息，且與傳統(tǒng)測序技術相比，前期使用抗生素對檢測結果的影響較小。

      病原體耐藥檢測：耐藥性微生物病原體的不斷出現(xiàn)是一個具有全球重要性的問題。雖然正在開發(fā)新藥，但是它們的廣泛使用很快就會選擇進一步的抗藥性，對于肺部感染病人，我們常常會遇到由于不充分或長期使用廣譜抗生素而產(chǎn)生耐藥性的患者，這時候則需要對于抗生素相關毒性和多藥抗性病原體的鑒定，最新有指南建議在診斷膿毒癥后盡早（最好在1小時內(nèi)）開始經(jīng)驗性抗生素治療[58]，那么在這一階段，對于致病病原體的鑒定及抗生素抗性和毒力基因的分析對于早期優(yōu)化抗微生物治療方案是至關重要的。Grumaz 等[59]的研究驗證了二代測序檢測耐藥基因的可行性，而在最新NGS技術（即Oxford Nanopore的MinION裝置）表明，已可以在更短的時間內(nèi)對更大量的DNA進行測序，且已被證實使用該技術鑒定臨床相關菌株和相應的抗性譜可在約2小時內(nèi)完成，抗性基因的鑒定也可在2至12小時內(nèi)可以控制，這大大縮短診療時間[60]。

在肺部感染的眾多病原體中，病毒感染占據(jù)了重要位置，由于病毒結構簡單的特點，易發(fā)生突變， 其基因組一旦發(fā)生任何變化均會影響后代的特性表 現(xiàn)。在抗病毒藥物治療時，病毒基因的異質(zhì)性使其 在藥物治療過程中常出現(xiàn)耐藥相關基因的突變，從而影響抗病毒治療效果。VERWEIJ P E等的研究發(fā)現(xiàn)使用廣譜抗生素影響真菌與細菌之間微生態(tài)平衡，導 致呼吸道真菌感染的發(fā)生以及病原體對抗真菌藥產(chǎn)生耐藥［61］。微生物監(jiān)測已被認為是抗藥性控制的基本組成部分，因為監(jiān)測信息可以評估抗藥性負擔，確定風險因素，并確定抗性表型和基因型的趨勢。隨著NGS技術的發(fā)展，有多項試驗都證實了NGS能檢出 0.１％ ～１％水平的病毒耐藥突變，且應用NGS技術可進行耐藥病毒株的傳播、低豐度耐藥突變與臨床用藥關系、抗病毒藥物 潛在作用靶點的探索、抗病毒治療后患者耐藥位點 突變的檢測和探尋新耐藥突變位點等方面的研 究［62.63.64］ 。如巨細胞病毒（CMV）的抗病毒治療可能因與磷酸轉移酶UL97和DNA聚合酶UL54突變相關的耐藥性而變得復雜。Sahoo M K 等[65]利用二代測序技術開發(fā)了一種基于擴增子的高通量測序策略，用于檢測臨床血漿樣本中的CMV藥物抗性突變，該測定提供了對較小變體的更靈敏的檢測和更高的多重能力。

耐多藥的醫(yī)院病原體是醫(yī)院的主要負擔?？焖倬垲愯b定和病原體分析，即抗生素抗性和毒力基因，對于有效的感染控制至關重要。特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）現(xiàn)在是醫(yī)院感染的主要原因之一。Leopold 等[66]利用WGS與等位基因分析相結合的方法，篩選出了1681個基因建立 cgMLST分型方法，對德國明斯特大學醫(yī)院兩間ICU病房的t001型 MRSA 進行了監(jiān)測，WGS結果產(chǎn)生了高分辨力的等位基因譜，通過分析該等位基因譜將18株MRSA菌株分為兩簇，并使用標準化的基因組提取基于等位基因的分型以及抗生素抗性和毒素基因譜，抗生素抗性譜與原始臨床實驗室易感性譜一致，而毒素譜還提供了一些以前未知的信息。Holden MT等[67]使用比較基因組分析確定了99.8％的MRSA分離株抗菌素耐藥性表型的分子遺傳基礎，突出了病原體基因組測序作為診斷工具的潛力，證明當前大流行的EMRSA-15群體來自于20世紀80年代在整個英格蘭傳播的與衛(wèi)生保健相關的MRSA流行病，證實了全基因組測序不僅可以為分子流行病學提供高度辨別力，而且可以為抗生素抗性提供預測。

     另外，由于結核分枝桿菌生長速度極慢，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)和表型方法進行耐藥譜檢測至少要花費幾個星期，所以結核分枝桿菌耐藥性的研究一直是該領域的熱點[68]。多重耐藥結核病（MDR-TB）的出現(xiàn)和傳播一直是控制結核病的嚴重威脅，且這種情況因更嚴重的廣泛耐藥性結核?。╔DR-TB）的出現(xiàn)而得到加強。MDR-TB菌株已對所有氟喹諾酮類藥物（FQ;特別是氧氟沙星，左氧氟沙星，莫西沙星和加替沙星）和所有二線注射藥物（阿米卡星，卷曲霉素和卡那霉素）產(chǎn)生耐藥性。在2014年，世界衛(wèi)生組織（WHO）建議將認可的快速分子技術（Xpert MTB / RIF，線性探針檢測）納入監(jiān)測系統(tǒng)和調(diào)查，以便在國家層面測試更多結核病（TB）患者的耐藥性。Cabibbe A M等[69]認為全基因組測序（WGS）方法正在成為流行病學和耐藥性常規(guī)監(jiān)測的更強大工具，有望快速同時篩查所有臨床相關突變，以確定對第一，第二線的抗性和新的抗結核藥物。WGS技術對病原體的高跟蹤力、高辨別力使得其戰(zhàn)勝傳統(tǒng)分子工具，以標準化方式提供深入和廣泛的信息。經(jīng)典測序和NGS方法已成功應用于最近在結核病和耐多藥結核?。∕DR-TB）負擔高的五個國家進行的研究。使用DNA測序鑒定pncA基因及其啟動子區(qū)域（pncA區(qū)域）中的突變以確定對PZA的基因型抗性，旨在通過pncA測序研究結核病患者對吡嗪酰胺的耐藥水平[70]。這項工作創(chuàng)新地證明了在國家（外圍和參考實驗室）和超國家實驗室之間建立了強有力的聯(lián)系，前者可能處理間接或直接樣本并生成測序數(shù)據(jù)，后者支持它們進行生物信息學分析和數(shù)據(jù)解釋， 2013年的一項回顧性研究，研究者在分枝桿菌生長指示試管（ＭＧＩＴ）培養(yǎng)患者痰液，3天后直接從培養(yǎng)物中提取DNA，并使用Illumina Miseq 測序儀進行測序。結果鑒定出患者混合感染了２種不同的結核多藥耐藥菌株，并通過耐藥基因的變異情況預測了其耐藥譜，這項研究揭示了快速全基因組測序的潛力，且大大減少了診斷XDR結核病的時間[71]。Farhat MR等[72]使用116個新測序的和7個先前測序的結核分枝桿菌全基因組，我們鑒定了對47 種耐藥菌株特異性的陽性 選擇的全基因組特征，恢復了100％的已知抗性標記，對一種基因ponA1突變的功能性遺傳分析證明了在藥物利福平存在下的體外生長優(yōu)勢。

病原體毒力檢測：

微生物毒力是一種復雜的、多因素的表型，與病原體的進化軌跡錯綜復雜地聯(lián)系在一起，是許多細菌病原體的主要毒力因子，影響任何感染嚴重性的關鍵因素就是感染生物的毒力潛力，許多病原菌中的毒力島一般指染色體上一段編碼細菌毒力 的DNA片段，兩側常有重復序列和插入元件，其DNA片段 的G+C 百分比、密碼使用與宿主菌染色體具有明顯差異。目前有相關研究表明，二代測序技術可以直接從其基因組序列確定毒力表型從而預測毒力，如Laabei M等利用全基因組關聯(lián)研究（GWAS）和機器學習方法確定了從90株MRSA分離株的基因組序列中預測毒力的可行性，證實了使用全基因組序列數(shù)據(jù)分析大量菌株以鑒定與特定性狀相關的遺傳特征可用于從基因型推斷復雜表型[73]。