免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的操作步驟比較多，要得到一個(gè)完美的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不僅需要高質(zhì)量的抗體，對免疫沉淀體系也需要有嚴(yán)格的控制指標(biāo)。在免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)過程中，從蛋白樣品處理、抗體-瓊脂糖珠復(fù)合物洗滌到最后的鑒定，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)關(guān)鍵步驟的質(zhì)量，才能達(dá)到最終的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)流程

該免疫共沉淀操作步驟是將抗體先結(jié)合到蛋白A/G瓊脂糖珠上，然后再與抗原混合。相對其他方法，最終的得率較低，但避免了抗體共洗脫的問題。如果希望獲得高純度的目的蛋白，而不考慮非特異性結(jié)合，可以將抗體和蛋白樣品在加入蛋白A/G瓊脂糖珠之前進(jìn)行混合，這樣最后抗體也會(huì)和目的蛋白一同被洗脫下來，從而可能會(huì)對蛋白質(zhì)印跡法（western blot）檢測造成干擾。

操作步驟

1. 用預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干磷酸緩沖液；
2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer（1 ml/10⁷個(gè)細(xì)胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm²培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5×10⁶個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm²培養(yǎng)瓶）;
3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮離，把懸液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5ml EP管中。并置于低速搖床，4℃緩慢晃動(dòng)15min（EP管插冰上，置水平搖床上）；
4. 4℃，14000rpm離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中；
5. 將Protein A/G瓊脂糖珠用磷酸緩沖鹽溶液洗兩遍，用磷酸緩沖鹽溶液配制成50%的Protein A/G瓊脂糖珠工作液，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠；
6. 在樣品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G瓊脂糖珠工作液。水平搖床4℃搖動(dòng)10min（EP管插冰上，置水平搖床上），該步驟的目的是去除非特異性結(jié)合的蛋白；
7. 4℃，14000rpm離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A/G瓊脂糖珠；
8. 做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（Bradford 法），測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月）；
9. 用磷酸緩沖液將總蛋白稀釋到1μg/μl以降低裂解液中去垢劑的濃度。如果覺得你的目的蛋白的濃度低了，可以將總蛋白濃度提高到10μg/μl（假設(shè)濃度足夠）;
10. 加入一定體積的抗體到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因與它有作用的蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異；
11. 4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫2h；激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2h室溫孵育；
12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2μl過渡抗體；
13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集沉淀，并且用預(yù)冷的洗滌緩沖液（或者預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液）洗滌3遍（每次加入800μl），RIPA Buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用磷酸緩沖鹽溶液；
14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）；
15. 以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性；

注：RIPA配制：150mM Nacl，1%乙基苯基聚乙二醇，1%脫氧膽酸鈉，25mM Tris-HCl緩沖液（PH7.6)，0.1%SDS。

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)流程

通過免疫共沉淀確定未知結(jié)合蛋白

該實(shí)驗(yàn)的思路為：先通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，得到結(jié)合蛋白，隨后對得到的結(jié)合蛋白進(jìn)行測序。

1. 用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中；
2. 將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4℃以最大速度離心15min；
3. 收集上清（約30 ml）并加入30 μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h；
4. 加入0.9 ml的瓊脂糖蛋白A懸液，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min；
5. 用含900 mmol/L NaCl的NETN洗瓊脂糖蛋白A混合物，再重復(fù)洗5次。最后，用NETN洗一次；
6. 吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4min；
7. 將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10mA的恒定電流下電泳過夜；
8. 通過考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶；
9. 從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min；
10. 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再進(jìn)行電洗脫；
11. 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽進(jìn)行Edman降解測序。

注意事項(xiàng)

1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP-40 或Triton- X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定;
2）不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑;
3）使用對照抗體：單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗;兔多克隆抗體：正常兔IgG;
4）確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；
5）要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀；
6）確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。