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免疫共沉淀（CoIP）概述及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方法，屬于免疫沉淀技術(shù)的一類，常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中未知蛋白組分。免疫共沉淀的設(shè)計(jì)理念是，假設(shè)一種已知蛋白是某個大的蛋白復(fù)合物的組成成員，那么利用這種蛋白的特異性抗體，就可能將整個蛋白復(fù)合物從溶液中“拉”下來（常說的“pull-down”），進(jìn)而可以用于鑒定這個蛋白復(fù)合物中的其他未知成員。免疫共沉淀的特點(diǎn)可以概括為兩點(diǎn)，第一是天然狀態(tài)，第二是蛋白復(fù)合 RIPA Buffer配制物。 基礎(chǔ)成分： Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性） NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集） NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液） 去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液；避光保存） 注意：準(zhǔn)備激酶（致活酶）實(shí)驗(yàn)時，不要加去氧膽酸鈉，因?yàn)殡x子型去污劑能夠使酶變性，導(dǎo)致活性喪失。 RIPA蛋白酶抑制劑 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200 mM 的儲存液，室溫保存） EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100 mM 的儲存液，PH 7.4） 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1 mg/ml 的儲存液，分裝，-20℃保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1 mg/ml 的儲存液，分裝，-20℃保存） 胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml 的儲存液，分裝，-20℃保存） RIPA磷酸（酯）酶抑制劑 激活的Na3VO4（用H2O配制成200 mM 的儲存液，見Sodium Orthovanadate Activation Protocol） NaF（200 mM 的儲存液，室溫保存） 注意：在準(zhǔn)備做磷酸（酯）酶實(shí)驗(yàn)的時候，不加磷酸酯酶抑制劑 工作液配制： 配制100 ml 的modified RIPA buffe： 1. 稱取790 mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900 mg 的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調(diào)節(jié)PH值到7.4。 2. 加10 ml 10%的NP-40 。 3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清 。 4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存 。 5. 理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑各100 μl； PMSF， Na3VO4， NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定，30分鐘就會降解一半，所以PMSF應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天。 各種成分在工作液中的終濃度： Tris-HCl： 50 mM， pH 7.4 NP-40： 1% 去氧膽酸鈉：0.25% NaCl： 150 mM EDTA： 1 mM PMSF： 1 mM 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑： 各1 μg/ml Na3VO4： 1 mM NaF： 1 mM 1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS。 2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer（1 ml/107個細(xì)胞、10 cm 培養(yǎng)皿或150 cm2 培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5×106個細(xì)胞、6 cm 培養(yǎng)皿、75 cm2 培養(yǎng)瓶）。 3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5 ml EP管中，4℃，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。 4. 4℃，14000 g 離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。 5. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。 6. 每1 ml 總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。 7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子。 8. （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）。 9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 μg/μl）。 10. 加入一定體積的兔抗到500 μl 總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異。 11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2 h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。 12. 加入100 μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1 h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl“過渡抗體”（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。 13. 14000 rpm 瞬時離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800 μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS。 14. 用60 μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl 足夠上三道）。 15. 將上樣樣品煮5 min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5 min 變性。 來源：丁香通
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