以上對(duì)話發(fā)生在小編剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室、還跟在師兄后面打轉(zhuǎn)的時(shí)候。嘖嘖嘖，這snapgene真的這么強(qiáng)大么？于是小編去找軟件親自用了下，果然厲害。

        做質(zhì)粒圖譜、直觀的查找酶切位點(diǎn)、標(biāo)記基因片段屬性、直觀查看引物所在位置，查看開(kāi)放閱讀框所編碼氨基酸、直觀的序列比對(duì)……snapgene簡(jiǎn)直就是做分子克隆的利器啊。

        這么好用的軟件當(dāng)然要讓大家都知道啦~今天小編就以實(shí)驗(yàn)室用的經(jīng)典版本為例，整理介紹一下snapgene的主要功能和操作流程，希望能幫到各位初接觸分子克隆的小白們。

         （文末附有軟件壓縮包哦，進(jìn)入公眾號(hào)在輸入框回復(fù)“snapgene”即可獲得下載鏈接。點(diǎn)擊文章標(biāo)題下的藍(lán)色字“易科學(xué)即可進(jìn)入公眾號(hào)”）

        運(yùn)行軟件，界面如圖所示。選擇新建dna文件，將從網(wǎng)上得到的序列復(fù)制粘貼入框中，命好名字。對(duì)于質(zhì)粒，Topology選擇circular（環(huán)形），勾選Detect common features，將一些質(zhì)粒共有的常見(jiàn)的特征加入其中，結(jié)果會(huì)如下圖，

        選擇add 10 features 就可以生成一個(gè)高大上的質(zhì)粒圖譜了。當(dāng)然，我們也可以直接在諸如addgene這樣的網(wǎng)站內(nèi)上下載現(xiàn)成的dna文件或者gbk文件啦~

        在這個(gè)視圖上我們可以直觀的看到很多的信息，包括酶切位點(diǎn)，啟動(dòng)子（promoter），增強(qiáng)子（enhancer），復(fù)制起始位點(diǎn)（ori），抗性篩選標(biāo)記，HA等蛋白標(biāo)簽等等，點(diǎn)左側(cè)的按鈕可以選擇顯示不顯示這些信息。在這個(gè)圖上，酶切位點(diǎn)和引物的位置和相對(duì)關(guān)系等信息可以說(shuō)是一目了然，這對(duì)于我們?cè)诮⒖寺r(shí)選取酶切位點(diǎn)，測(cè)序鑒定克隆時(shí)選取測(cè)序引物都是十分便利的。

        圖譜是在MAP視圖下看到的結(jié)果，我們還可以在sequence視圖下來(lái)分析序列。這個(gè)視圖下我們可以很清楚看到序列信息，包括堿基序列信息、由不同的開(kāi)放閱讀框得到的氨基酸序列信息。在這里我們可以自由調(diào)整氨基酸的三字母縮寫(xiě)和單字母縮寫(xiě)形式。在這個(gè)視圖下酶切位點(diǎn)、引物、蛋白標(biāo)簽等參考信息還都是存在的，因此我們?cè)谶@個(gè)視圖下設(shè)計(jì)引物會(huì)十分方便。

        Enzyme視圖下，我們可以看到各個(gè)內(nèi)切酶的位點(diǎn)和數(shù)目，但小編認(rèn)為這樣反倒不如在圖譜中看得更直接一些了。

        Feature視圖下，可以查看常見(jiàn)的的質(zhì)粒共同特征，除了常見(jiàn)的這些，也可以自己人為的添加特征標(biāo)簽，可以自主的設(shè)計(jì)特征的類型，特征序列的大小，讀取方向，起始位置是否分片段等等。

        在多克隆位點(diǎn)處找到合適的兩個(gè)酶切位點(diǎn)。在目的基因上下游截取15-30bp序列，點(diǎn)擊Primers→Add primers。如圖：

        給該引物命名，然后點(diǎn)擊Insertion，在該引物上添加之前選擇好的酶切位點(diǎn)序列，如圖選擇了EcoR I，點(diǎn)擊Insert即可完成（必要時(shí)需要加保護(hù)堿基），還可以在引物上添加多肽標(biāo)簽，如6×His等。最后點(diǎn)擊add primer to template，即可完成引物設(shè)計(jì)與添加。

        Snapgene具有序列比對(duì)的功能。當(dāng)測(cè)序結(jié)果送到，我們需要比對(duì)檢測(cè)我們建立的克隆是否序列正確。如下圖所示，先在snapgene中打開(kāi)你的測(cè)序結(jié)果，選擇View → Align With A Sequence Trace, 然后選取你比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文件，比如你的目的基因序列，即可得到序列比對(duì)圖。

        如圖是小編的一個(gè)測(cè)序結(jié)果，小編在某蛋白的基因上構(gòu)建了兩個(gè)氨基酸的點(diǎn)突變，對(duì)點(diǎn)突變質(zhì)粒的測(cè)序比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個(gè)錯(cuò)配（mismatch）和1個(gè)間斷（gap），這些會(huì)用紅色標(biāo)出。5個(gè)錯(cuò)配就是小編設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)，而除了這五個(gè)之外，其余都是一一對(duì)應(yīng)，表明我點(diǎn)突變得到的質(zhì)粒只在目標(biāo)位置有突變，其余都正確，而1個(gè)間斷是因?yàn)樾【幵诘鞍椎腃端添加了flag標(biāo)簽，而目的蛋白基因到C端即直接是TGA終止密碼子，所以有間斷，這也是預(yù)期內(nèi)的結(jié)果。所以小編建立的點(diǎn)突變是可用的啦~

        Snapgene具有模擬建立克隆的功能，這使得我們?cè)O(shè)計(jì)建立克隆方案更加簡(jiǎn)便，如果克隆過(guò)程設(shè)計(jì)方案有缺陷，我們可以借助模擬發(fā)現(xiàn)并做出糾正。Snapgene可以模擬的標(biāo)準(zhǔn)限制性克隆也可以模擬融合克隆。步驟分別如下

①打開(kāi)需要被插入片段的質(zhì)粒圖譜，點(diǎn)擊Actions → insert fragments。

②切載體。在質(zhì)粒中選取合適的酶切位點(diǎn)，單酶切直接點(diǎn)擊該酶即可，雙酶切則需要按住shfit按鍵再點(diǎn)擊兩個(gè)酶，這樣即完成載體的酶切；

③切目的基因片段。選取insert→source of insert，將需要插入的目的基因片段序列文件加入其中，在目的基因片段中選取同樣的兩個(gè)酶進(jìn)行酶切，必要時(shí)點(diǎn)擊調(diào)整方向使其匹配，點(diǎn)擊clone完成模擬。

        打開(kāi)需要被插入片段的質(zhì)粒圖譜，點(diǎn)擊Actions →in-fusion ?cloning →insert one fragments。

①在vector 選項(xiàng)卡，選取要插入的位點(diǎn)或者要替換的區(qū)域。在這里，小編準(zhǔn)備隨意替換掉質(zhì)粒上的抗性bla（β-內(nèi)酰胺酶）區(qū)域，選取該段。

②在fragment選項(xiàng)卡，選替換片段，注意該片段閱讀方向與被替換質(zhì)粒位點(diǎn)的方向是否一致，如不一致，點(diǎn)擊更換方向。這里小編選取卡那抗性。

③在product選項(xiàng)卡點(diǎn)擊Choose Overlapping PCR Primers，即可設(shè)計(jì)好引物，形成融合后的質(zhì)粒圖譜。可以看到原來(lái)的β-內(nèi)酰胺酶區(qū)域已經(jīng)被替換成了卡那抗性標(biāo)記。

若想獲得引物的序列，點(diǎn)擊Primers→Export Selected Primers，選擇保存。

        以上就是snapgene一些主要功能和操作流程，具體的例子小編都是隨意模擬展示的，請(qǐng)大家不要深究。希望這些能幫到各位使用snapgene的同學(xué)們。如果有不懂的地方，大家可以去官網(wǎng)查看視頻教學(xué)。鏈接http://www./products/snapgene/about_snapgene/