簡介和前期文章

我對之前的所有教程進行了再次詳細的總結
CRISPR-Cas9基因編輯之背景介紹及gRNA設計（上）

前言：

在上一次文章中，我們已經(jīng)得到了在線工具設計的sgRNA序列，經(jīng)由簡單評估后選擇出合適的sgRNA

1. 使用Snapgene anneal oligo

以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 為案例，根據(jù)給出的PTEN sgRNA，完善oligo序列，并再Snapgene軟件中匹配出來

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使用Snapgene一鍵生成oligo，Actions--Anneal Oligos

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粘貼事先準備好的序列--保存Oligo文件

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2. 使用Snapgene模擬插入質(zhì)粒后的情況

（1）打開一個pSpCas9質(zhì)粒--actin--restriction cloning--insert fragment

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（2）在Vector選項卡，選擇內(nèi)切酶為BbsI，在insert部分選擇上一步中保存好的oligo，最后點擊clone，保存DNA文件。

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（3）打開插入后的質(zhì)粒圖譜，檢查oligo插入情況，無誤后可提交上表中的PTEN-Oligo.Top/Bottom至公司合成。

3. 設計檢測所需引物

這里檢測所用的引物和平時做PCR檢測mRNA表達的引物是不同的，這里的PCR產(chǎn)物必須覆蓋基因編輯的位置，且產(chǎn)物要足夠長，至少500 bp。在這里我們以P53為例子：

（1）找到包括sgRNA序列的前后1000個堿基的序列（2000 bp）

（2）將找到的序列復制粘貼到blast中https://www.ncbi.nlm./tools/primer-blast/

設置參數(shù)

（3）得到結果（小測試，為何得到的引物只有兩對，而且似乎有一對還偏離中心很遠，請問應該如何設置，使得產(chǎn)物聚集在中心？）

（4）查看引物基本情況，檢查無誤可提交公司合成

結語：以上，我們則是完成了sgRNA及引物設計，提交公司合成，拿到之后則可開始正式實驗了，感興趣的同學，可以完成上面的小測試，有問題請在下方留言，拜拜~