前沿：前幾天我們推送了西南大學農學與生物科技學院的關于qPCR引物設計數據庫“再也不用自己設計qPCR引物了，請收藏！”今天收到熱心粉絲“莫莫先生”寫的具體使用方法，在這里表示感謝。

材料：

1、http://www./ （國家水稻數據中心）

2、http://rapdb.dna.affrc./ （水稻注釋數據庫）

3、http://rice.plantbiology./index.shtml （水稻基因組數據庫）

4、http://biodb./qprimerdb/ (qPCR引物設計軟件）

5、https://www.ncbi.nlm./tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome （引物比對網站）

方法：以設計COLD1的qPCR引物為例。

1、尋找COLD1基因號

2、點擊登入號Os04g0600800

3、點擊Os04t0600800-01并復制

4、打開qPrimerDB database

5、依次選擇水稻qPCR引物數據庫

6、進入水稻數據庫，點擊GeneID

7、輸入COLD1基因號

8、點擊Filter,找到目標區(qū)域

9、點擊Os04t0600800-01,選擇引物。紅色框表示引物GC含量，一般選擇45左右；綠色框是上下游引物的TM值一般58左右；黃色框可以顯示更多的引物選項；藍色框表示擴增片段大小，一般200以內；紫色框為引物覆蓋度，一般選100；黑色框是跨外顯子數目，依據自己需要選擇。

10、選擇好引物，點擊藍色框框primerID,獲得全面信息。（primer pair sequences)

11、復制引物序列，即為COLD1 qPCR引物

12、NCBI-blast驗證引物

13、輸入引物

14、依次如下選擇,Get primers

15、如圖所示，引物特異性很好！可以送公司合成啦！以此類推只要有準確的基因號就能找到對應的qPCR引物。

附錄：qPrimerDB database說明

Web界面和用法 

瀏覽功能：在我們的數據庫中，147個生物體按分類和字母順序排列。為了提高瀏覽效率，147種生物最初被分為三類：動物、植物和其他真核生物。將80種動物進一步分組包括4種鳥類和爬行動物、10種魚類、17種昆蟲、37種哺乳動物和12種其它動物的組，而66個植物被分成幾組包括39種雙子葉，18種單子葉植物和9個其它植物。此外，147個生物按照基于科學名稱的字母順序進行分類。有兩種方式來瀏覽所有的有關資料，對目標生物qPCR引物。我們以模型植物“A.擬南芥”為例，展示了QprimerDB中的瀏覽功能。

第一個方法，用戶可以獲得感興趣的生物信息通過在“主頁”搜索對應的分類學和科學名稱。依次單擊“植物”、“雙子葉植物”和“A. thaliana ”?！敖Y果”頁面顯示25 995個基因的最佳引物對的詳細信息，包括引物ID ，基因ID，引物水平，上游引物序列，下游引物序列，引物覆蓋度，擴增體大小，擴增GC含量，前引物TM，反向引物TM，前引物ΔG，反向引物ΔG，和跨越外顯子的數目。25995個記錄顯示在2600頁中，每頁有10條條目（默認情況下），可以通過將“顯示行”更改為20, 30, 50、100, 200或500來調整。也可以通過選擇“排序升序”或“排序降序”來更改在“結果”表的每個列中顯示的值的順序，并且可以通過不同的方式搜索列中的關鍵字， 選擇“包含”、“不包含”和“相等”等術語。通過引物和ID列中藍色矩形中的超鏈接，可以為每個基因獲得更詳細的信息。例如，用戶可以通過單擊引物ID A.thaliana.005900.v1的超鏈接查看AT1G72390最佳引物的詳細信息，包括基因描述、引物描述、“所有AT1G72390引物”的超鏈接和擴增序列及模板序列。對于AT1g72390所有引物的表可以通過點擊超鏈接的AT1g72390'中的'最好的'頁面查看擬南芥引物或“所有引物AT1g72390在細節(jié) 引物A.thaliana.005900.v1。然后，所有引物的詳細信息可以通過點擊感興趣的引物ID查看。

使用第二種方法，用戶可以通過在導航欄中選擇“瀏覽”來瀏覽感興趣的，然后從“收藏夾”、“植物”或“通過字母”頁面選擇“A.擬南芥”。瀏覽步驟所描述和第一個方法一樣。