對(duì)于分子生物學(xué)的研究者來講，NCBI是科研過程中的一大神器，我們不僅可以在其中查找基因組、基因、蛋白，還可以在其中進(jìn)行文獻(xiàn)查找、序列比對(duì)等操作，連設(shè)計(jì)引物的功能NCBI也給我們構(gòu)建好了，名字叫做Primer designing tool或者Primer-BLAST。

并且，基于NCBI龐大的數(shù)據(jù)庫(kù)信息，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)引物擴(kuò)增特異性的預(yù)測(cè)，甚至直接設(shè)計(jì)出特異性良好的qPCR引物(預(yù)測(cè)值)。這也是NCBI相比于其他引物設(shè)計(jì)工具最大的特點(diǎn)。因此該工具尤其適合設(shè)計(jì)特異性的熒光定量或半定量PCR引物。下面，將詳細(xì)介紹這種特異性qPCR引物的設(shè)計(jì)方法：

1. 找到基因序列頁(yè)面

關(guān)于序列的查找，在上一期的微信推送中小編已經(jīng)作了詳細(xì)介紹，沒有關(guān)注到的同學(xué)在主頁(yè)面中回復(fù)“序列查找”即可獲取相關(guān)推送信息。

2. 跳轉(zhuǎn)到Primer designing tool

① 在基因頁(yè)面中，點(diǎn)擊Pick Primers，即可以直接跳轉(zhuǎn)到Primer designing tool的頁(yè)面。

② 如果已經(jīng)有了基因的序列，可以不通過基因查找頁(yè)面，直接進(jìn)入Primer designing tool。具體的入口是NCBI——BLAST——Primer-Blast。

3. 設(shè)置引物設(shè)計(jì)相關(guān)參數(shù)

引物設(shè)計(jì)頁(yè)面共分為PCR模板、引物參數(shù)、外顯子/內(nèi)含子選擇和特異性檢測(cè)參數(shù)四個(gè)模塊，下面將對(duì)這四個(gè)模塊中的設(shè)置進(jìn)行詳細(xì)講解。

① PCR Template

如果您是通過查找序列轉(zhuǎn)到Primer designing tool的，那么在PCR Template欄中則會(huì)自動(dòng)出現(xiàn)您的基因的編號(hào)，比如對(duì)于human β-actin來講，其mRNA的頁(yè)面點(diǎn)擊Pick Primer之后，PCR Template欄中會(huì)出現(xiàn)其對(duì)應(yīng)編號(hào)：NM_001101.3。如果是直接進(jìn)入Primer designing tool界面，則需要將目的基因的編號(hào)或者序列粘貼進(jìn)該框中。在右側(cè)的Range欄中，可以設(shè)定正反向引物的結(jié)合范圍。

② Primer Parameters

引物參數(shù)欄中，前兩行是引物的序列欄，用于對(duì)已有的引物進(jìn)行特異性分析，在設(shè)計(jì)引物的過程中并不會(huì)用到，因此留空即可。在PCR product size一行中，可以設(shè)定PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍，對(duì)于qPCR來講，范圍設(shè)為50~250時(shí)結(jié)果比較精確，可以先設(shè)定一個(gè)較小的范圍，如80~150，如果該范圍內(nèi)沒有設(shè)計(jì)出比較好的引物，則可以返回?cái)U(kuò)大產(chǎn)物大小范圍。# of primers to return是指軟件設(shè)計(jì)引物的數(shù)量(如果有的話)，默認(rèn)為10對(duì)。引物的Tm值一行中，可以設(shè)定引物的最大、最小和最佳Tm值，以及正反向引物Tm的最大差值。對(duì)于qPCR來講，默認(rèn)的即為最佳Tm值60°C，不需做任何修改。

③ Exon/intron selection

在抽提RNA的過程中，樣本中的基因組DNA污染會(huì)顯著影響最終的結(jié)果，雖然可以使用DNase I進(jìn)行處理將RNA樣本中的中DNA降解掉，但是很難保證DNA降解完全。由于真核生物的基因組由內(nèi)含子和外顯子組成，而成熟的mRNA僅包含外顯子而沒有內(nèi)含子，因此，在設(shè)計(jì)qPCR引物時(shí)，經(jīng)常會(huì)選用跨外顯子的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而保證該引物不會(huì)對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

在Primer Design Tool中，我們可以進(jìn)行跨外顯子設(shè)置，該設(shè)置有三個(gè)不同的選項(xiàng)，分別代表：對(duì)跨外顯子無要求、一對(duì)引物中至少一條一定要跨外顯子以及引物可以不跨外顯子。要注意，選擇后兩項(xiàng)時(shí)，PCR模板欄中必須要填寫NCBI中序列的登錄號(hào)，如mRNA的NM號(hào)，以便于程序識(shí)別其中的外顯子拼接位點(diǎn)。如果手動(dòng)粘貼序列，則會(huì)因?yàn)闊o法定位外顯子而設(shè)計(jì)失敗。

Exon junction span一欄的下方可以對(duì)引物跨外顯子的其他參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，如跨外顯子引物在前后兩個(gè)外顯子的配對(duì)堿基數(shù)、內(nèi)含子長(zhǎng)度、擴(kuò)增產(chǎn)物是否允許在統(tǒng)一外顯子上等。

④ Primer Pair Specificity Checking Parameters

良好的引物特異性能夠保證在qPCR過程中只擴(kuò)增出目的基因的片段，而不會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合與擴(kuò)增產(chǎn)物，這對(duì)保證qPCR結(jié)果的真實(shí)可靠是至關(guān)重要的。除了在qPCR最后一步添加熔解曲線檢測(cè)步驟，我們更應(yīng)該在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候就保證引物的特異性，哪怕僅僅是在軟件預(yù)測(cè)的層面上。

Primer Design Tool的最后一部分參數(shù)設(shè)置就是針對(duì)引物特異性檢測(cè)的。首先，要確保Specificity check一欄中已經(jīng)打勾。Search mode一般選擇Automatic即可，這樣當(dāng)用戶輸入的模板在比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)中有很多相似的序列時(shí)（比如一段DNA序列在多個(gè)轉(zhuǎn)錄變體中都有），用戶可以選擇哪一些是需要檢測(cè)的PCR模板。Database是指特異性檢測(cè)所用到的數(shù)據(jù)庫(kù)：對(duì)于常用的檢測(cè)基因表達(dá)上下調(diào)變化，一般選擇Refseq mRNA，因?yàn)榇藭r(shí)PCR模板是mRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；若要檢測(cè)lncRNA，該數(shù)據(jù)庫(kù)就應(yīng)該選擇覆蓋面更廣的Refseq RNA。若模板是基因組，則應(yīng)該選擇Refseq representative genomes。在Exclusion行中，可以對(duì)預(yù)測(cè)的序列以及環(huán)境/不可培養(yǎng)樣本序列的干擾。Organism是指樣本所屬物種，將物種名稱如：Homo sapiens(或直接human)輸入，選擇候選欄中對(duì)應(yīng)的物種即可。也可以直接輸入物種ID (常用的如：人9606，小鼠10090，大鼠10114)。在Organism下方，可以對(duì)特異性要求的嚴(yán)格程度進(jìn)行設(shè)置，比如引物對(duì)非特異結(jié)合位置至少要有幾個(gè)不匹配堿基等。在Splice variant handling一欄中，我們可以勾選上，使得引物由“轉(zhuǎn)錄本特異”變?yōu)椤盎蛱禺悺?，即能與該基因的多個(gè)轉(zhuǎn)錄變體結(jié)合。但需要注意的是，該選項(xiàng)只能保證設(shè)計(jì)出的引物可以結(jié)合多個(gè)轉(zhuǎn)錄變體，但并不能保證所有的轉(zhuǎn)錄變體都能檢測(cè)到。

如果需要設(shè)計(jì)能夠覆蓋所有轉(zhuǎn)錄變體的引物，可以參考上一期的微信推送中“多轉(zhuǎn)錄變體的共有序列查找”一文，將所有轉(zhuǎn)錄變體的共有序列粘貼到序列框中即可。

⑤ 高級(jí)參數(shù)設(shè)置

在Advanced parameters中，我們可以進(jìn)一步對(duì)引物的參數(shù)信息進(jìn)行調(diào)整，如特異性檢測(cè)參數(shù)、引物長(zhǎng)度、GC含量范圍等等。其中比較常用到的是最后一項(xiàng)：內(nèi)部雜交寡核苷酸(Internal hybridization oligo)，可以在此進(jìn)行Taqman探針的設(shè)計(jì)。

雖然上面羅嗦了這么多，但實(shí)際上大多參數(shù)在Primer designing tool中已經(jīng)預(yù)設(shè)好了，無需做任何改動(dòng)。絕大多數(shù)情況下，我們只需要調(diào)整PCR產(chǎn)物大小、引物Tm值、物種等參數(shù)即可。參數(shù)設(shè)置結(jié)束之后，點(diǎn)擊“Get Primers”，即可等待結(jié)果的出現(xiàn)了。

4. 設(shè)計(jì)結(jié)果中優(yōu)秀引物的選取

這里以人的GAPDH為例，該基因有四個(gè)轉(zhuǎn)錄變體，將轉(zhuǎn)錄變體的共有序列粘貼到序列框中，產(chǎn)物大小設(shè)置為80-150 bp，另外為了保證引物質(zhì)量，將Max Poly-X設(shè)置為3，即引物中不能出現(xiàn)超過三個(gè)以上連續(xù)相同堿基。

點(diǎn)擊Get Primers，系統(tǒng)會(huì)對(duì)這段序列進(jìn)行Blast，彈出以下界面讓您選擇對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本，由于我們粘貼了共有序列，因此四個(gè)轉(zhuǎn)錄本都會(huì)列出，這里點(diǎn)擊“All”將這四個(gè)都選中，之后點(diǎn)擊Submit提交。

經(jīng)過一段時(shí)間的等待，我們得到了NCBI設(shè)計(jì)的引物序列，如下圖所示有三對(duì)引物，每一對(duì)引物的特性和序列都羅列其中。

引物的特性有以下幾個(gè)方面：序列、模板鏈、長(zhǎng)度、起止位置、Tm、GC含量、自我互補(bǔ)能力、產(chǎn)物大小以及引物對(duì)應(yīng)的模板。其中多數(shù)特性都或多或少影響了引物的好壞，比如：序列中最好不要出現(xiàn)連續(xù)的相同堿基（尤其在3端）；正反向引物的Tm值要接近；以O(shè)ligo dT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，引物的起止位置要盡量靠后；引物對(duì)的自我互補(bǔ)配對(duì)打分要盡量低。根據(jù)上述幾個(gè)簡(jiǎn)單規(guī)則，很快就能夠在NCBI反饋的結(jié)果中挑取到合適的引物了。

當(dāng)然，所有這些引物特性都是根據(jù)公式打分得到的，只是起到了建議的作用，并不能代表該引物的實(shí)際使用情況，特性好的引物在實(shí)際使用過程中不一定表現(xiàn)優(yōu)秀，反之特性不好的引物也不一定不能夠使用，但是NCBI的引物設(shè)計(jì)工具憑借基因序列直達(dá)引物設(shè)計(jì)的入口、其豐富的設(shè)置選項(xiàng)、特異性預(yù)測(cè)的功能還是得到了廣大科研工作者的青睞，熟悉掌握了該工具，將為您的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)起到很大幫助！