果子導讀：

如果做基礎(chǔ)實驗，分子克隆是必不可少的。分子克隆的步驟很多，如果想要學習的話，一定要找一個會做的團隊，完整地看幾次才行，不建議自學。
就跟western blot一樣，步驟多，而且只要沒有出條帶，每一步的嫌疑都不能排除。想起我剛做分子克隆那會，很長時間內(nèi)一個克隆都沒有長出來 ，所以我也不知道究竟是哪一步除了問題。當我的板子上面出現(xiàn)一個克隆時，我已經(jīng)在崩潰的邊緣，根本不相信會有上面好結(jié)果。直到一個好心的師妹，順帶幫我挑了克隆，才發(fā)現(xiàn)那一個居然時成功的，至此我知道我的操作沒有任何問題，從那以后分子克隆就是標配了。

要說分子克隆中最困難的步驟，大家可能想不到，是PCR，這里的PCR的目的是為了獲取目的條帶，最終連入質(zhì)粒內(nèi)。PCR的引物設(shè)計很重要，在那之前，豆子老師給大家準備了一期普通qPCR的引物設(shè)計來熱身。
說起來，我挺喜歡豆子老師的敘事風格的，很穩(wěn)，一點都不花哨。敘述的過程中融入自己的心得體會，對初學者十分友好。

以下是今天的正文。

這期來探討一下引物設(shè)計，由于做基因合成需要加保護堿基以及酶切位點，可能剛開始不是特別好理解，所以我們先來探討一下普通qPCR的引物設(shè)計，這樣可以讓我們對引物設(shè)計先有一個大概的了解，先了解在線設(shè)計引物以及設(shè)計引物時的注意事項，然后再來探討一下可以設(shè)計引物的軟件以及blast，最后來看一下啟動子引物的設(shè)計。

先以CYLD用NCBI在線設(shè)計一下引物：

如果你不想了解那么多，那么這段也夠了，在你目的基因中點擊Pick Primers（怎么找在前面已經(jīng)探討過），大多參數(shù)在Primer designing tool中已經(jīng)預設(shè)好了，我們只需要調(diào)整PCR產(chǎn)物大小50-250、引物Tm值（不用調(diào)整）、物種（你已經(jīng)選擇）以及在Advanced parameters中將Max Poly-X設(shè)置為3，點擊“Get Primers”，即可等待結(jié)果的出現(xiàn)了。

接下來就是詳細步驟及為何如此選擇的原因，從NCBI找到基因前面的步驟我們之前已經(jīng)探討過，直接到目的就可以看到右邊

點擊Pick Primers，進入引物設(shè)計頁面

可以看到PCR Template欄中會出現(xiàn)其對應(yīng)編號：NM_015247.2，如果你已經(jīng)有序列，可以在框中直接粘貼你的序列。在右側(cè)的Range欄中，可以設(shè)定正反向引物的結(jié)合范圍。

再往下拉就是引物參數(shù)欄，前兩行是引物的序列欄，如果你已經(jīng)有引物那么就可以進行特異性分析，但是在引物設(shè)計的過程中并不會用到，不要管就行。在PCR product size一行中，可以設(shè)定PCR引物的擴增產(chǎn)物長度范圍，對于qPCR來講，范圍設(shè)為50-250時結(jié)果比較精確，可以先設(shè)定一個較小的范圍，如80-150，如果該范圍內(nèi)沒有設(shè)計出比較好的引物，則可以返回擴大產(chǎn)物大小范圍。of primers to return是指軟件設(shè)計引物的數(shù)量默認為10對，如果引物少于10對時，有幾對就會顯示幾對。引物的Tm值一行中，可以設(shè)定引物的最大Max、最小Min和最佳Tm值，以及正反向引物Tm的最大差值difference。對于qPCR來講，最佳Tm值60℃，不需做任何修改。

大家都知道真核生物的基因組由內(nèi)含子和外顯子組成，而成熟的mRNA僅包含外顯子而沒有內(nèi)含子，因此在設(shè)計qPCR引物時，經(jīng)常會選用跨外顯子（是外顯子-外顯子，而不是內(nèi)含子-外顯子）的方法進行設(shè)計，從而保證該引物不會對基因組DNA進行擴增，這時候肯定在思考我們提的是RNA，為什么會對基因組DNA進行擴增，因為在提RNA的過程中，雖然可以進行處理將RNA樣本中的DNA降解掉，但是很難保證DNA降解完全，而樣本中的基因組DNA會顯著影響最終的結(jié)果。

在Primer Design Tool中第一行有三個不同的選項，分別代表：對跨外顯子無要求、一對引物中至少一條一定要跨外顯子以及引物可以不跨外顯子。要注意，選擇后兩項時，PCR模板欄中必須要填寫NCBI中序列的登錄號，如mRNA的NM號，以便于程序識別其中的外顯子拼接位點。如果手動粘貼序列，則會因為無法定位外顯子而設(shè)計失敗。

再往下拉就是針對引物特異性檢測的。引物特異性就是保證在擴增過程中只擴增出目的片段。要確保最上面一欄中打勾。Search mode一般選擇Automatic即可，因為如果輸入為序列時，就會發(fā)現(xiàn)你所輸入的序列可能在好幾個變體中都會存在，在比對的數(shù)據(jù)庫中就會顯示出來，你就可以選擇需要檢測的PCR模板。Database是指特異性檢測所用到的數(shù)據(jù)庫：對于常用的檢測基因表達上下調(diào)變化，一般選擇Refseq mRNA，因為此時PCR模板是mRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；若要檢測lncRNA，該數(shù)據(jù)庫就應(yīng)該選擇覆蓋面更廣的Refseq RNA。若模板是基因組，則應(yīng)該選擇Refseq representative genomes。在Exclusion行中，可以對預測的序列以及環(huán)境/不可培養(yǎng)樣本序列的干擾。Organism是指樣本所屬物種，將物種名稱選擇候選欄中對應(yīng)的物種即可。也可以直接輸入物種ID (常用的如：人9606，小鼠10090，大鼠10114)。在Organism下方，可以對特異性要求的嚴格程度進行設(shè)置，比如引物對非特異結(jié)合位置至少要有幾個不匹配堿基等。在Allow splice varians一欄中，我們可以勾選上，使得引物為基因特異，即能與該基因的多個轉(zhuǎn)錄變體結(jié)合。但需要注意的是，該選項只能保證設(shè)計出的引物可以結(jié)合多個轉(zhuǎn)錄變體，但并不能保證所有的轉(zhuǎn)錄變體都能檢測到。

在Advanced parameters中，我們可以進一步對引物的參數(shù)信息進行調(diào)整，如特異性檢測參數(shù)、引物長度、GC含量范圍，一般將Max Poly-X設(shè)置為3，即引物中不能出現(xiàn)超過三個以上連續(xù)相同堿基，點“Get Primers”，就可以得到如下：

這就是我們得到的引物，每個引物的詳細信息都可以看到。

上面只是讓大家對引物設(shè)計簡單的了解一下以及看一下其中出現(xiàn)的一些參數(shù)，接下來我們就對引物設(shè)計里面的參數(shù)以及需要注意的方面進一步來探討一下：

（1）引物長度    
引物的長度控制著產(chǎn)物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火溫度。引物的長度一般為15-30bp，最好在18-27bp，但不能超過38bp，如果擴增產(chǎn)物小于500bp，引物長度18bp即可，如果擴增產(chǎn)物為4-5kb，引物最好不要少于24bp，上下引物長度差別不要大于3kb。引物每增加一個核苷酸,引物特異性提高4倍。太短易形成錯配, 降低特異性；長PCR引物能給擴增帶來更好的特異性,不過長引物通常更易于形成包括發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體自身互補等二級結(jié)構(gòu)，同時引物過長會導致其延伸溫度大于74℃，即超過Taq酶的最適溫度。

（2）引物堿基

PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當?shù)扔诨蚋哂谒枰糯蟮哪０錑C/AT比。GC含量一般為40-60%為宜，以45-55%為宜，過高過低都不利于擴增。GC含量太少導致引物的Tm值較低，不利于PCR特異性，GC含量過高易出現(xiàn)非特異擴增。引物中四種堿基最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列如GGGGG等，也不要出現(xiàn)二核苷酸重復序列，如GCGCGC等。上下游引物的GC含量不要相差太大。附加序列加到5'端, 在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們。引物對的Tm差異不超過5℃，設(shè)計時溫度和GC含量是個主要的參數(shù)，做復合擴增時更要設(shè)計成相近的溫度，而且引物加個尾影響不大。但要切記不管如何設(shè)計的引物都要BLAST，這個我們后面就會涉及到，如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃, 或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。

（3）引物Tm值

DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度。一般要求：55℃-65℃。對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算。對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計軟件最常用的計算方式Tm = △H/(△S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+]))-273.15，一般軟件都會自帶有Tm值，所以不要擔心。

（4）引物的二級結(jié)構(gòu)

引物的3’端序列比5’端重要，在3’端的堿基盡量不要用A或AA以及AAAA。。。因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高，3’端堿基最好為G或C但不要超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)，5’端序列對PCR影響較小，同時3’端不要終止于密碼子的第三位，因為密碼子的第三位容易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性和效率。    引物之間出現(xiàn)的配對能形成引物二聚體，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級結(jié)構(gòu)，二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，特別是3'端的互補問題會更為嚴重，3’末端配對很容易引起引物二聚體擴增。它會使引物二聚體擴增而減少目的擴增，由于引物二聚體的能值過高（超過4.5kcal/mol），不僅可能產(chǎn)生非特異的擴增條帶，而且可能通過降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。

發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補堿基分子內(nèi)配對造成,引物折疊形成的二級結(jié)構(gòu)，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子內(nèi)的反應(yīng)，僅僅需要三個連續(xù)堿基配對。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量,自由能大小取決于堿基配對釋放的量以及折疊DNA形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量，如果自由能值大于0則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而不會干擾反應(yīng)。如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。

錯配：如果引物可以結(jié)合除目的位點外的其他區(qū)域，擴增效率將明顯降低目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)錯配。3’末端連續(xù)幾個堿基配對形成錯配的可能性要更大，所以引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。在使用引物設(shè)計軟件時，引物在模板內(nèi)一定具有單一性，也就是說在模板內(nèi)部沒有錯配。引物設(shè)計好后，最好做blast檢測，檢查同一物種基因組中是否存在高度同源序列。

（5）引物的保存

引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫最多可以保存2個月。

幾種設(shè)計引物的軟件，先有個印象，以后我們會慢慢熟悉Primer Premier,Oligo,DNAstar,Beacon Designer以及一些在線的等等。