（通過CRISPR切割引入編碼熒光蛋白的PCR片段，同源臂長度只需33個(gè)核苷酸）

“作為一個(gè)已被廣泛使用的基因修改工具，CRISPR本身只會(huì)造就基因組斷裂，它并不能控制一段新DNA序列如何插入基因組，”約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院負(fù)責(zé)本院基礎(chǔ)科研相關(guān)工作的副院長Geraldine Seydoux博士說?！坝谑?，我們想了解細(xì)胞修復(fù)DNA斷裂損傷的天然機(jī)理，利用這種機(jī)制，在CRISPR處理后更高效地為基因組引入新序列。”

“我們驚訝地發(fā)現(xiàn)，只要外源DNA是線性的，細(xì)胞就非常樂意復(fù)制這條外源序列來修復(fù)自己的DNA斷裂，”Seydoux補(bǔ)充道?！巴ㄟ^反復(fù)研究外源DNA片段的復(fù)制過程，我們提出了一些簡單而有效的法則，顯著改善了CRISPR的編輯效果?！?/p>

本質(zhì)上，CRISPR是一把分子剪刀。科學(xué)家們普遍認(rèn)為，CRISPR剪切后，細(xì)胞通過插入一組隨機(jī)核苷酸來修復(fù)DNA斷裂，通常來講，DNA發(fā)生斷裂的基因就這樣被破壞了。

細(xì)胞有時(shí)也會(huì)使用來自供體的DNA修復(fù)斷裂，但這些新供體序列自己不能主動(dòng)插入基因組的切口。它們需要在“同源臂（homology arms）”的幫助下讓兩個(gè)末端與基因組上切口兩端的序列連接。同源臂的DNA序列需要與其插入的DNA切口兩端的遺傳密碼完全匹配。

盡管如此，科學(xué)家們認(rèn)為這種依靠供體DNA序列的基因組修復(fù)方法十分低效。如果插入片段很長，它可能需要較長的同源臂，制備起來就很困難。

劃重點(diǎn)

為了解決這些問題，約翰霍普金斯的科學(xué)家們嘗試向人類胚胎腎細(xì)胞中注入各種各樣的供體DNA組合。它們發(fā)現(xiàn)，線性DNA片段供體的工作效率最高，是環(huán)狀DNA（質(zhì)粒）的2到5倍。“線性DNA我們用PCR就能生產(chǎn)，”助理研究員Alexandre Paix說。

他們還測試了不同長度的同源臂，發(fā)現(xiàn)約35個(gè)核苷酸的效果最好，這實(shí)際上比科學(xué)界普遍采用的同源序列長度要短得多。

具體來說，實(shí)驗(yàn)證明由33到38個(gè)核苷酸組成的同源臂與由518個(gè)核苷酸組成的同源臂成功率相當(dāng)：最優(yōu)編輯條件下的成功率約10-20%。

相反，采用15-16個(gè)核苷酸長度的同源臂時(shí)，成功率下降了一半。研究人員在基因組的三個(gè)不同位置檢測，都得到一致的結(jié)果。

他們還發(fā)現(xiàn)，插入序列的長度（不包括同源臂）最高可容納1000個(gè)核苷酸。1000以下的成功率大約為10-50%，超過1000（例如1122和2229個(gè)核苷酸）成功率下降至0.5%。“細(xì)胞一次性可能處理不過來這么多的DNA，”Seydoux說。

文章建議，在CRISPR剪切位點(diǎn)附近30個(gè)核苷酸以內(nèi)插入，這樣編輯的成功率最高。他們表示，這些參數(shù)應(yīng)該適用于目前正在被研究的絕大多數(shù)基因。

最后，他們還在小鼠胚胎中測試了這些“法則”的效果。利用帶有36個(gè)核苷酸同源臂的PCR片段，該小組成功地將一個(gè)長度為739的熒光蛋白編碼基因插入了87只小鼠胚胎中的27只，成功率達(dá)到了31%。