麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)博德分校的David Liu團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種新的CRISPR基因組編輯方法：新方法將分子生物學(xué)中兩個(gè)最重要的蛋白質(zhì)—— CRISPR-Cas9和逆轉(zhuǎn)錄酶——整合到一起。

該系統(tǒng)稱為"prime editing,"，能夠以精確、高效和高度通用的方式直接編輯人體細(xì)胞。該方法擴(kuò)大了生物學(xué)和治療學(xué)研究的基因編輯范圍，并有可能糾正多達(dá)89％的已知致病基因變異。

“分子生命科學(xué)的一個(gè)主要愿景是具有能夠在任何位置精確地改變基因組的能力。我們認(rèn)為prime editing使我們更接近這個(gè)目標(biāo)?！盌avid Liu是核心研究所成員、Richard Merkin教授、麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Board學(xué)院醫(yī)療轉(zhuǎn)化技術(shù)Merkin研究所負(fù)責(zé)人，也是這篇發(fā)表在《自然》上的文章高級(jí)作者?！拔覀冞€沒(méi)有發(fā)現(xiàn)別的基因編輯技術(shù)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提供這樣高水平的多功能性和精確度，而副產(chǎn)物又如此之少。”第一作者安德魯·安扎洛（Andrew Anzalone）Broad學(xué)院Liu實(shí)驗(yàn)室的Jane Coffin Childs博士后。

Prime editing與以前的基因組編輯系統(tǒng)不同，在人細(xì)胞中它使用RNA指導(dǎo)新DNA序列的插入。

Cas9蛋白是第一個(gè)用于在人類細(xì)胞中進(jìn)行基因組編輯的CRISPR工具，它是由Broad研究所（麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)）率先開(kāi)發(fā)的（前段時(shí)間Broad和張峰初步打贏了CRISPR的官司，不過(guò)最近CRISPR訴訟又開(kāi)始了）。Cas9會(huì)在每條DNA鏈上切割，從而完全切割斷裂DNA。這工具可以在特定位置破壞靶基因，使之能夠通過(guò)重組將新的DNA重組到這個(gè)位點(diǎn)，讓添加新的序列成為可能。

早前由Liu的實(shí)驗(yàn)室首先開(kāi)發(fā)的編輯工具Base editor基于此技術(shù)，將Cas9與其他能夠進(jìn)行單個(gè)堿基置換反應(yīng)的蛋白質(zhì)融合，當(dāng)前版本的Base editors可以有效地進(jìn)行四種類型的單堿基置換：C到T，T到C，A到G和G到A。

新的prime editing系統(tǒng)則是將Cas9與另一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的蛋白質(zhì)偶聯(lián)。這個(gè)分子復(fù)合物使用目標(biāo)DNA位點(diǎn)的一條鏈“引導(dǎo)”或“啟始”直接將編輯過(guò)的遺傳信息“寫(xiě)入”基因組。

一種新的合成guide RNA，稱為pegRNA，負(fù)責(zé)將prime editor引導(dǎo)至其靶位點(diǎn)，在這里，經(jīng)過(guò)修飾的Cas9會(huì)切割DNA的一條鏈。 pegRNA還包含了另外一段新編輯序列的RNA核苷酸。逆轉(zhuǎn)錄酶讀取這段RNA延伸的新編輯序列，并將其逆轉(zhuǎn)錄寫(xiě)入靶點(diǎn)DNA。

按需求進(jìn)行編輯

在《自然》雜志的論文中，研究小組證明了prime editor技術(shù)能夠準(zhǔn)確糾正導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞性貧血的基因變異——需要將特定的T轉(zhuǎn)化為A；還有Tay Sachs?。ㄒ环N罕見(jiàn)神經(jīng)性疾病，黑蒙癡呆癥）——要求在基因組的精確位置去除四個(gè)DNA堿基。

研究人員進(jìn)一步報(bào)告了一系列在人類細(xì)胞和原代小鼠神經(jīng)元中各種成功的編輯類型，包括用單堿基置換的所有12種可能方式、插入長(zhǎng)達(dá)44個(gè)DNA堿基的新DNA片段、精確刪除多達(dá)80個(gè)DNA堿基，和結(jié)合了這些不同類型編輯的修飾。

“通過(guò)prime editor，我們現(xiàn)在可以將鐮狀細(xì)胞貧血突變直接改回正常序列，并去除導(dǎo)致Tay Sachs病的四個(gè)額外的DNA堿基，而無(wú)需完全切割DNA，不需要DNA模板，”David Liu表示。他不單是哈佛大學(xué)化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)教授，還是霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員。“該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于，對(duì)編輯的序列幾乎沒(méi)有限制。由于添加的核苷酸是由pegRNA指定的，因此它們可以是與原始鏈僅一個(gè)字母不同，具有更多或更少字母、或這些變化的各種組合?！?/p>

“隨著我們開(kāi)發(fā)這項(xiàng)技術(shù)，prime editor的多功能性很快變得顯而易見(jiàn)，” Anzalone回憶說(shuō)?！拔覀兛梢詫⑿碌倪z傳信息直接復(fù)制到目標(biāo)位點(diǎn)，這真是出乎意料。我們感到非常興奮。”

研究人員報(bào)告說(shuō)，進(jìn)行精確修改時(shí)，相比需要在每條DNA鏈上進(jìn)行鄰近斷裂的方法，prime editing能夠成功實(shí)現(xiàn)基因編輯，而“脫靶”的副作用發(fā)生率很低。根據(jù)研究小組的數(shù)據(jù)，prime editing還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)原來(lái)base editor難以訪問(wèn)的靶序列進(jìn)行精確的單核苷酸置換。

Liu的團(tuán)隊(duì)打算繼續(xù)優(yōu)化prime editing，包括最大程度地提高prime editing在許多不同細(xì)胞類型中的效率，進(jìn)一步研究prime editing對(duì)細(xì)胞的潛在影響，在疾病的細(xì)胞和動(dòng)物模型中進(jìn)行更多測(cè)試，并探索在動(dòng)物中的遞送機(jī)制為將來(lái)在人體治療應(yīng)用探索途徑。

研究人員和Broad Institute免費(fèi)向?qū)W術(shù)界和非營(yíng)利性社區(qū)提供此技術(shù)，包括通過(guò)非營(yíng)利性Addgene共享載體，不需要許可證（棒！）。

Broad Institute提供prime editing工具，以非排他性地許可用于公司的研究和制造以及工具和試劑的商業(yè)開(kāi)發(fā)。對(duì)于人類治療用途，博德研究所已在包容性創(chuàng)新模式下將該技術(shù)許可給Prime Medicine。正如公開(kāi)報(bào)道的那樣，Beam Therapeutics已從Prime Medicine獲得了分許可，以在某些領(lǐng)域和某些應(yīng)用中使用prime editing。（Liu是Prime Medicine和Beam Therapeutics的顧問(wèn)和聯(lián)合創(chuàng)始人。）