基因 (組) 編輯是指通過人工構(gòu)建工程化的核酸酶，對基因組目標(biāo)區(qū)間序列特異性識別與 切割，定點(diǎn)切割產(chǎn)生雙鏈斷裂 (Double-stranded break，DSB)，并通過細(xì)胞內(nèi)源的同源重組或非同源末端連接DNA損傷修復(fù)機(jī)制，對受體物種基因或基因組引入目標(biāo)基因敲除、缺失、插入、替換、修飾或染色體易位與重排等定向突變的技術(shù)。在生命科學(xué)領(lǐng)域，基因組編輯技術(shù)最重要的生物學(xué)意義是可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)定向突變，即按照人類的設(shè)想精確設(shè)計(jì)想要的基因型。因此，該技術(shù)在生物基礎(chǔ)科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)、工業(yè)微生物、作物遺傳改良等廣泛領(lǐng)域具備重大的理論與實(shí)踐應(yīng)用研究價(jià)值?；蚓庉嫾夹g(shù)體系根據(jù)其定點(diǎn)核酸酶技術(shù)原理，可分為歸巢核酸酶技術(shù) (Meganucleases)、鋅指核酸酶 (Zinc finger nuclease， ZFN)、類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶 (Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)，以及成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR) CRISPR/Cas 系統(tǒng)基因編輯技術(shù)。近年來，CRISPR/Cas 系統(tǒng)基因編輯技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)，由于其設(shè)計(jì)簡便、系統(tǒng)簡單易行、定點(diǎn)突變效率高等優(yōu)點(diǎn)，正在成為基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重要的基礎(chǔ)工具。然而，基因替換尤其是大片段 DNA替換編輯仍存在突變效率低與精確性差等技術(shù)限制。本文主要綜述了植物基因替換編輯研究進(jìn)展。 
 

通過基因編輯產(chǎn)生的突變根據(jù)突變基因的功能又可分為無義突變和有義突變。無義突變主要有堿基插入或缺失移碼而導(dǎo)致的基因敲除、基因刪除和倒位突變體。有義突變主要有基因的替換、基因修飾以及定點(diǎn)插入。最近報(bào)道實(shí)現(xiàn)的基因組的單堿基編輯可實(shí)現(xiàn)單堿基替換，該技術(shù)實(shí)質(zhì)上通過基因定點(diǎn)單堿基修飾。 

本文所討論的基因替換是指可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)區(qū)域較長 DNA 區(qū)段精確定向突變的技術(shù)，可引入任意人為目標(biāo)突變，使 DNA 精確地整合到基因組中所需的位置，并穩(wěn)定表達(dá)。例如，Susan M Byrne 等通過 CRISPR/Cas9 技術(shù)對人體多功能 干細(xì)胞進(jìn)行替換研究，成功用老鼠的同源序列部分替換了人的相應(yīng)序列。與其他突變相比，任何DNA序列的突變都可以通過較大片段的基因 (DNA) 替換來實(shí)現(xiàn)。因此，基因替換編輯技術(shù)具備真正意義上的定向突變能力，在農(nóng)作物遺傳改良與基因功能鑒定基礎(chǔ)研究中具有重大的理論價(jià)值與實(shí)際應(yīng)用意義。 

 
基因替換編輯技術(shù)包括核酸酶剪切模塊和模板修復(fù)模塊兩個(gè)部分,核酸酶剪切單一位點(diǎn)或 多個(gè)位點(diǎn)可由 ZFNs、TALENs 和 CRISPR-Cas9 完成，修復(fù)模板分為 DNA 雙鏈或寡核苷酸鏈?；谕粗亟M (Homologous directed recombination， HDR) 修復(fù)途徑的 DNA 雙鏈修復(fù)模板同源臂長度從數(shù)百bp至幾kb不等，寡核苷酸鏈修復(fù)模板同源臂約 60 nt，核酸酶識別位點(diǎn)位于同源臂兩端；基于非同源末端連接 (Non-homologous end joining，NHEJ) 途徑的修復(fù)模板無同源臂， 核酸酶識別位點(diǎn)位于模板兩端。 

基因替換編輯技術(shù)的步驟主要包括剪切和修復(fù)兩個(gè)過程，受體基因組目標(biāo)位點(diǎn)被核酸酶識別剪切，產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂，修復(fù)模板基于同源重組修復(fù) (HDR) 或非同源末端連接 (NHEJ) 途徑進(jìn)行替換，HDR 相對于 NHEJ 修復(fù)途徑更為精確，但由于細(xì)胞周期中 HDR 活性存在時(shí)間短，效率低于 NHEJ。 

在基因替換編輯中，依據(jù)目標(biāo)基因替換的類型，可分為基因替換、啟動子等調(diào)控因子替換以及基因敲入。依賴內(nèi)源 DNA可分為通過細(xì)胞內(nèi)源的 HDR 或 NHEJ DNA 損傷修復(fù)機(jī)制，可通過這兩種機(jī)制引入基因替換或插入突變。 

3.1 依賴 HDR 修復(fù)途徑的基因替換編輯 

對所有真核生物來說，利用基因替換方法準(zhǔn)確地將新的等位基因引入基因組具有一定的挑戰(zhàn)性。雖然使用CRISPR/Cas9的基因敲除在許多植物中得到應(yīng)用，但是迄今為止僅有少數(shù)基于 CRISPR/Cas9 的基因敲入或替換的報(bào)道。為了使用 CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)基因敲入，必須使用 DNA 模板作為修復(fù)供體序列，通過HDR 修復(fù)雙鏈斷裂，替換到指定的區(qū)域。HDR 是一種精確的修復(fù)方式，它可以保證細(xì)胞基因組的完整性，在DNA修復(fù)中起著舉足輕重的作用。 HDR 途徑活性一般發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂的 S 期 到 G2 期，但修復(fù)精確度高。其誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變大部分為同源供體DNA介導(dǎo)的大片段的插入或核苷酸修正。 

CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變和敲除已被用于水稻和擬南芥原生質(zhì)體。最近，該技術(shù)也成功地用于在水稻中替換了兩個(gè)乙酰乳酸合酶基因，從而賦予水稻對除草劑雙草醚的抗性。雖然已經(jīng)有一些成功的案例，但在植物中普遍進(jìn)行基因敲入和替代的策略仍然具有挑戰(zhàn)性。

HDR 相結(jié)合的 CRISPR/Cas9 剪切有可能克服這一挑戰(zhàn)。在哺乳動物細(xì)胞中，研究人員已經(jīng)通過用 Cas9/sgRNA 復(fù)合物靶向基因的同時(shí)用化合物Scr7抑制DNA連接酶Ⅵ和/或抑制 NHEJ 所需的基因(即編碼 ku70 和 ku80 的基因)，通過同源重組的基因替換效率顯著增強(qiáng)。這種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)顯著抑制了 NHEJ DNA 修復(fù)活性，并刺激 Cas9-/sgRNA 誘導(dǎo)的 DNA 斷裂位點(diǎn)的同源重組效率提高。實(shí)際上，使用ZFN介導(dǎo)的基因靶向的報(bào)告顯示，在涉及 NHEJ 修復(fù)的 smc6b 和 ku70 或 lig4 中，突變擬南芥中的基因編輯和同源重組增加。最近，在玉米和大豆中證明了同源重組的有效基因替換。使用雙鏈或單鏈 DNA 分子作為替代鏈，通過啟動轉(zhuǎn)入未成熟玉米胚胎的 Cas9 和 sgRNA 基因?qū)崿F(xiàn)了 5 個(gè)不同 靶基因的等位基因編輯。

通過 CRISPR/Cas9 剪切，同源重組率可以通過增加供體DNA的拷貝數(shù)，提高大約一個(gè)數(shù)量級。在近期的一項(xiàng)研究中，核酸酶構(gòu)建體可以對改良大豆黃矮病毒基因組進(jìn)行編碼，該病 毒能在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。模板同樣在該復(fù)制子上編碼，其側(cè)翼是靶基因切割位點(diǎn)側(cè)翼 DNA 的同源序列。將該復(fù)制子序列通過農(nóng)桿菌T-DNA 轉(zhuǎn)入番茄細(xì)胞。此外，預(yù)計(jì)會導(dǎo)致滾環(huán)式復(fù)制，并產(chǎn)生數(shù)百到數(shù)千個(gè)復(fù)制。使用該復(fù)制子觀察到的基因靶向效率約為 10%，比所觀察到的非復(fù)制型 T-DNA 載體序列增加一個(gè)數(shù)量級。該研究結(jié)合了同一實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果，證明修復(fù)序列的高拷貝數(shù)與位點(diǎn)特異性 DNA 切割有效地通過同源修復(fù)過程促進(jìn)基因靶向。 

3.2 依賴 NHEJ 修復(fù)途徑的基因替換編輯

NHEJ 修復(fù)是細(xì)胞的主要修復(fù)方式。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈斷裂時(shí)，DSBs 處被一些末端結(jié)合因 子蛋白結(jié)合，防止 DSBs 被核酸酶降解。隨后，DSBs由于這些蛋白的相互作用使裂口處的 DNA 雙鏈相互靠近，DNA 鏈就通過連接酶的作用連接從而修復(fù)斷裂的 DNA 雙鏈。NHEJ 途徑活性高且持續(xù)整個(gè)細(xì)胞分裂周期并傾向差錯(cuò)修復(fù) (Error prone repair)。其產(chǎn)生的突變大部 分為少量核苷酸的插入或刪除。由于NHEJ修復(fù)中DSBs的修復(fù)沒有模板，所以發(fā)生的概率要高于 HDR 途徑所介導(dǎo)的基因替換。但由于其不依賴同源序列重組，對修復(fù)重連的 DNA 沒有選擇性，會導(dǎo)致引入錯(cuò)誤的修復(fù)，精確性較差。 

除了通過 HDR的遺傳整合，也可以用 NHEJ完成靶向基因的插入或替換。在這種情況下， 不包含側(cè)翼同源性臂的線性供體分子在被 NHEJ 修復(fù)期間在DSB被捕獲。這種方法經(jīng)常用于哺乳動物細(xì)胞中，但在植物中的使用鮮有報(bào)道。隨著DSBs捕獲外源 DNA效率的進(jìn)一步提高，該方法成為將靶 DNA 整合到植物基因組中的潛在有效方法。高彩霞研究員與李家洋研究員利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)基于 NHEJ 修復(fù)方式在內(nèi)含子區(qū)域非同源末端連接修復(fù)機(jī)制，通過使用靶向相鄰內(nèi)含子的一對 sgRNA 和包含一對相同 sgRNA 位點(diǎn)的供體 DNA 模板，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了頻率為 2.0%的內(nèi)源性水稻基因 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (EPSPS) 的基因替換，同時(shí)通過基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因 2.2%的基因插入，并成功培育出具有抗除草劑水稻。這些新開發(fā)的方法通?？捎糜谠谒竞推渌参镏胁迦牖蛱鎿Q靶基因片段。

基因替換編輯技術(shù)中，靶向定點(diǎn)DNA的核酸酶、轉(zhuǎn)化策略、DNA修復(fù)供體模板以及內(nèi)源性 DNA損傷修復(fù)途徑等是影響基因替換效率的重要因素。 

DNA 修復(fù)模板可以通過基因槍轟擊的方法提供。Svitashev 等對授粉后 8–10d的未成熟玉米胚胎用基因槍進(jìn)行轟擊，與對照相比， Cas9-gRNA 處理的胚胎產(chǎn)生高頻率的突變，大多數(shù)測試的gRNA產(chǎn)生突變頻率大于 1.3%。通過基因槍轟擊，提供的修復(fù)模板拷貝數(shù)明顯增多，但同時(shí)也會存在一些缺點(diǎn)，如片段可能不完整、可能引起染色體重排、或受體基因組小片段外源 DNA 污染等。 

DNA修復(fù)模板還可以通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化提供。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是供體來自穩(wěn)定的系統(tǒng)，其中目標(biāo)生物體中的DNA模板可以更完整，并且替代物的殘余序列可以在后代的回交期間通過同源重組進(jìn)行精確追蹤和排除，從而產(chǎn)生“無轉(zhuǎn)基因”個(gè)體。本小組通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化提供的DNA修復(fù)模板獲得0.8%的頻率，這對于大多數(shù)植物研究來說是令人滿意的。使用 CRISPR/Cas9 和 DNA供體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化策略也在擬南芥中應(yīng)用于產(chǎn)生靶向突變。

修復(fù)模板的提供對基因替換編輯效率有很大影響。可以通過優(yōu)化供體DNA模板 (數(shù)量、長度、類型、導(dǎo)入方式等) 提高 HDR 介導(dǎo)的定點(diǎn)插入或替換效率。Baltes 等在煙草中利用雙生病毒 (Geminivirus) 載體表達(dá)序列特異核酸酶 (Sequence-specific nucleases，SSNs) 和 DNA 模板，通過提高 SSNs 和 DNA 模板數(shù)量，提高了同源重組效率。?ermák 等在番茄中利用雙生病毒復(fù)制子提高模板 DNA 含量，與傳統(tǒng)的 DNA 傳送方法相比，編輯位點(diǎn)的整合效率提高了10倍。 

也有研究人員通過優(yōu)化 DNA 模板同源臂 的長度來提高同源重組效率。雙鏈 DNA 模板的 同源臂長度一般為 1–4 kb，即在 DSB 兩側(cè)等分成大約 0.5–2 kb。Byrne 等使用小鼠對應(yīng)物替代內(nèi)源性人類基因的系統(tǒng)模型進(jìn)行了同源重組靶向載體設(shè)計(jì)參數(shù)的綜合研究，高達(dá) 11%的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞都實(shí)現(xiàn)了 2.7 kb 純合基因替換效率。研究發(fā)現(xiàn)同源長度在不與切割部位相鄰的臂上特別重要，而基因替換最佳同源臂長度約為2 kb。切割位點(diǎn)內(nèi)的同源序列對靶向效率是不利的。而 Shin 等利用 TALEN 技術(shù)建立了 GFP 報(bào)告系統(tǒng)，用于檢測活斑馬魚胚胎中HDR事件的發(fā)生頻率。通過共同注射具有不同大小同源臂的 TALE 核酸酶和 GFP 報(bào)告子靶向構(gòu)建載體，發(fā)現(xiàn)較長的同源臂和線性化的供體 DNA 載體更有利于同源重組，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在較短的一側(cè)同源臂的內(nèi)部切斷供體DNA載體獲得的同源重組效率最高，定點(diǎn)插入的傳代效率能達(dá)到10%以上。 

基因定點(diǎn)插入通常以雙鏈環(huán)狀載體或雙鏈線性DNA作為供體DNA，此外，還可以使用單鏈寡核苷酸 DNA (ssDNA)，其設(shè)計(jì)與合成比構(gòu)建雙鏈 DNA 載體更簡便。研究發(fā)現(xiàn), 單鏈或雙鏈 DNA 模板對同源重組均有效。Li等利用靶位點(diǎn)兩端各 1 kb 的同源臂，將外源潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因片段同源重組整合到大豆基因組中，得到具有潮霉素抗性的大豆植株。另外，較短基因序列的精確修飾可以采用單鏈寡核苷酸DNA作為模板，同源臂的長度甚至可以僅為40nt，即兩側(cè)各有20 nt。Puchta實(shí)驗(yàn)室建立了一種高效的基因靶向 (Gene targeting，GT) 系統(tǒng)來提高同源重組效率，首先在植物基因組上穩(wěn)定整合 SSNs 及供體 DNA 模板，SSNs 表達(dá)后同時(shí)切開基因組靶位點(diǎn)及供體DNA兩側(cè)的識別位點(diǎn)，釋放線性供體 DNA，發(fā)生HDR修復(fù)。傳統(tǒng)基因打靶實(shí)驗(yàn)中DNA模板由T-DNA載體提供，而植物體內(nèi)基因打靶在所有細(xì)胞及植物發(fā)育周期中都能發(fā)生，因此HDR發(fā)生頻率可能更高。

此外，NHEJ 和 HDR 兩個(gè)途徑也會對基因 替換編輯效率產(chǎn)生影響。與 NHEJ 途徑相比， 依賴 HDR 途徑修復(fù)的基因編輯效率較低。例如， 本小組實(shí)現(xiàn)的 HDR 基因替換編輯的頻率為 0.8%[33]。但在精確度方面，HDR 要優(yōu)于 NHEJ 途徑。盡管 NHEJ 相對于 HDR 容易出錯(cuò)，基因 片段可能被反向插入或在 DSBs 連接處產(chǎn)生核 苷酸的插入或缺失，但 NHEJ 的效率要遠(yuǎn)高于 HDR，因此在精確度要求不高的情況下，可以 選擇 NHEJ 途徑開發(fā)目標(biāo)基因替換的工具。 

5.1 基于基因替換的遺傳改良與育種應(yīng)用 

在玉米中，Svitashev 等利用單鏈寡核苷酸或雙鏈DNA載體作為修復(fù)模板編輯 ALS2 基因，通過HDR途徑將靶基因插入到目標(biāo)基因座， 得到氯磺隆抗性植株。Townsend等利用ZFN技術(shù)，通過HDR途徑分別定點(diǎn)替換煙草乙酰乳酸合成酶基因 (SuRA、SuRB) 的 3 個(gè)關(guān)鍵核苷酸位點(diǎn)，得到抗除草劑煙草，基因打靶效率在 0.2%–4%之間?；?CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，Sun 等通過 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組，對水稻 ALS 基因的兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的密碼子進(jìn)行定點(diǎn)替換，通過后代分離，獲得不含有轉(zhuǎn)基因元件的抗除草劑水稻。

5.2 基于基因替換報(bào)告系統(tǒng)在基因功能鑒定上的應(yīng)用 

基因表達(dá)的組織與細(xì)胞定位是基因功能鑒定分析的重要內(nèi)容，傳統(tǒng)方法是把報(bào)告基因構(gòu)建到推定的調(diào)控元件序列下游通過體外試驗(yàn)鑒定該基因的表達(dá)部位。由于是體外試驗(yàn)，不能完全模擬原目標(biāo)基因上下游基因組序列及組織、器官與個(gè)體等不同發(fā)育水平的背景，結(jié)果并不可靠?；?DNA 序列替換的定點(diǎn)敲入技術(shù)可把報(bào)告基因敲入目標(biāo)位置，從而可以實(shí)現(xiàn)通過報(bào)告基因在活體細(xì)胞、不同發(fā)育階段跟蹤該基因的表達(dá)特征，獲得準(zhǔn)確與完整的基因功能鑒定。Voytas實(shí)驗(yàn)室通過在煙草原生質(zhì)體中整合功能缺失的 gus:nptII 報(bào)告基因來檢測同源重組率，該基因上含有ZFN (Zif268) 識別序列， 再將ZFN和供體 DNA 轉(zhuǎn)入含有 gus:nptII 基因 的煙草原生質(zhì)體中，成功完成替換。Zhang 等在煙草原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)化 TALEN 和供體 DNA， 高達(dá) 14%的煙草原生質(zhì)體細(xì)胞 ALS 基因位點(diǎn)整合了YFP報(bào)告基因，能夠通過流式細(xì)胞術(shù)定量 TALEN 活性。Wang 等在小麥原生質(zhì)體細(xì)胞中通過 NHEJ 途徑介導(dǎo)不含啟動子的 GFP 報(bào)告基因插入 TaMLO 基因位點(diǎn)，并通過流式細(xì)胞儀檢測到 6.5%細(xì)胞有 GFP 表達(dá)，測序結(jié)果證明 GFP 按照正確讀碼框整合在 MLO 位點(diǎn)。 Fauser 等在擬南芥中利用 DGU.US 和 IU.GUS 兩個(gè)GUS報(bào)告基因系統(tǒng)，證明 Cas9 核酸酶和 Cas9 切口酶都能有效誘導(dǎo) HDR，且 Cas9 切口酶效率更高。 

5.3 基于定點(diǎn)敲入替換技術(shù)的定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用 

將外源 DNA引入植物基因組中預(yù)定的位置可為植物基因功能的研究提供有力的工具，并促進(jìn)作物新品種的發(fā)展?；诙c(diǎn)敲入替換技術(shù)的定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)首先在動物中得到應(yīng)用。Kamanaka 等設(shè)計(jì)了 GFP 敲入靶向載體，通過同源重組將GFP 整合到小鼠體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-10 (IL-10) 基因座并對其進(jìn)行分析。 在植物中，Shukla 等通過 ZFN 介導(dǎo)的基因打靶在玉米中實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)插入，使內(nèi)源基因插入失活，基因替換效率達(dá)到10%以上，并可以穩(wěn)定遺傳。Cai等將靶向煙草幾丁質(zhì)基因的 ZFNs 轉(zhuǎn)化煙草，并共轉(zhuǎn)兩端含有與靶基因同源的除草劑抗性標(biāo)記，成功獲得約10%定點(diǎn)插入抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)前的作物商業(yè)轉(zhuǎn)化事件均需要從大量隨機(jī)受體基因組整合的遺傳轉(zhuǎn)化事件中篩選優(yōu)良農(nóng)藝表現(xiàn)型的事件進(jìn)入應(yīng)用，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在受體基因組染色質(zhì)活性區(qū)域定點(diǎn)轉(zhuǎn)入目標(biāo)基因，可以有效提高研發(fā)與應(yīng)用效率，因此也具備重要的應(yīng)用價(jià)值。 

基因替換編輯通過核酸酶編輯技術(shù)以供體基因取代受體基因，可以實(shí)現(xiàn) DNA 的定點(diǎn)替換 與插入，可以對任何需要的目的 DNA 序列進(jìn)行修飾。在農(nóng)作物遺傳改良與基因功能鑒定基礎(chǔ)研究中具有重大的理論價(jià)值與實(shí)際應(yīng)用意義。 

基因替換的要素包括目標(biāo) DNA 核酸酶、替 換修復(fù)模板以及內(nèi)源 DNA 損傷修復(fù)。修復(fù)模板基于HDR或NHEJ途徑進(jìn)行替換，HDR 相對于 NHEJ 修復(fù)途徑更為精確，而在修復(fù)周期上會短于 NHEJ。由于向植物細(xì)胞導(dǎo)入同源重組供體片段和 DNA 同源重組的效率較低，對目標(biāo)基因進(jìn)行堿基替換、片段替換和定點(diǎn)插入等精準(zhǔn)編輯的效率低成為該技術(shù)的重大限制因素。因此，對于基因替換編輯來說，如何提高效率的同時(shí)保證編輯的精確性成為當(dāng)前迫切需要解決的關(guān)鍵科學(xué)技術(shù)問題。 

現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，可以通過優(yōu)化供體 DNA 模板，如增加供體 DNA 的拷貝數(shù)、優(yōu)化 DNA 模板同源臂的長度、改變供體模板的類型及導(dǎo)入方式等，使同源重組效率提高。另 一方面，也可以通過改變修復(fù)途徑來提高基因替換編輯效率。比如通過 CRISPR/Cas9 復(fù)合物靶向基因的同時(shí)，利用化合物抑制DNA 連接酶和/或抑制NHEJ所需的基因，來抑制NHEJ DNA 修復(fù)過程，并刺激 CRISPR/Cas9 誘導(dǎo)的DNA斷裂位點(diǎn)的同源重組效率提高。與HDR修復(fù) 一般發(fā)生在有絲分裂 S 期到 G2 期相比，NHEJ 修復(fù)在全細(xì)胞周期都具有較高活性，也可通過 NHEJ 完成靶向基因的插入或替換。高彩霞課題組運(yùn)用NHEJ在水稻中實(shí)現(xiàn)了頻率為 2.0%的內(nèi)源性水稻基因替換，并成功培育出具有抗藥性的水稻。此外，基因替換編輯效率可以從合適的轉(zhuǎn)化策略及對啟動子進(jìn)行優(yōu)化等方面來提高。本小組通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化提供的DNA修復(fù)模板獲得 0.8%的頻率。 

CRISPR/Cpf1 技術(shù)的出現(xiàn)為基于NHEJ修復(fù)方式的基因替換提供了新的方向。 CRISPR/Cpf1 技術(shù)裂解 DNA 后會產(chǎn)生 4–5 nt 的 粘性末端，根據(jù)受體產(chǎn)生的缺口，設(shè)計(jì)產(chǎn)生與其相互補(bǔ)的供體靶位點(diǎn)，在內(nèi)源 DNA 連接酶的作用下拼接，相對于平末端會更加精確。這一特點(diǎn)已被應(yīng)用于微生物載體的構(gòu)建，并取得了顯著的效果。相比于CRISPR/Cas9技術(shù)， CRISPR/Cpf1 技術(shù)因其粘性末端的特點(diǎn)會有更大的潛力。

植物中基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的同源重組效率較低，很難以此實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的單堿基突變。因此，植物育種和基因功能研究迫切需要新技術(shù)來提高基因組單堿基定點(diǎn)突變的效率，以實(shí)現(xiàn)基因功能與農(nóng)藝性狀的定向改良。目前較多的是在動物中的研究，Komor 等報(bào)道了一種新的基因組編輯方法，可以以可編程的方式直接且不可逆地將一個(gè)目標(biāo)DNA堿基替換為另一種堿基，而不需要 dsDNA 主鏈切割或供體模板。他們設(shè)計(jì)了 CRISPR/Cas9 的融合體， 在人和小鼠細(xì)胞中，在大約 5 個(gè)核苷酸的窗口內(nèi)轉(zhuǎn)化胞質(zhì)堿，介導(dǎo)胞苷到尿苷的直接轉(zhuǎn)化， 從而產(chǎn)生 C→T (或 G→A) 的替代。Kim等設(shè)計(jì)了含有突變的胞苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域的基因編輯，將編輯窗口的寬度從約5個(gè)核苷酸縮小到 1–2 個(gè)核苷酸，從而能夠區(qū)分相鄰的C核苷酸， 而且可以使疾病相關(guān)的靶標(biāo)Cs的數(shù)目加倍，并優(yōu)先于鄰近的非目標(biāo)Cs進(jìn)行校正。高彩霞研究組借鑒哺乳動物單堿基編輯方法，利用Cas9變體 (nCas9-D10A) 融合大鼠胞嘧啶脫氨酶 (rAPOBEC1) 和尿嘧啶糖基化酶抑制劑 (UGI)， 成功地在小麥、水稻和玉米基因組中實(shí)現(xiàn)高效、 精確的單堿基定點(diǎn)突變，并獲得了突變效率最高可達(dá) 43.48%的突變植株。單堿基編輯系統(tǒng)成功建立和應(yīng)用，為高效和大規(guī)模創(chuàng)制單堿基突變體提供了一個(gè)可靠方案，為作物遺傳改良和新品種培育提供了重要的技術(shù)支撐。 

從長遠(yuǎn)來看，基因組編輯技術(shù)能使人們對植物基因組特定基因 (位點(diǎn)) 進(jìn)行精準(zhǔn)、高效的改造，這將對植物功能基因組研究和作物遺傳改良產(chǎn)生巨大的推進(jìn)作用，并對未來農(nóng)業(yè)日益增長的需求提供可靠的保障。