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PCR技術(shù)原理與應(yīng)用
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span> 1、理解PCR的技術(shù)原理；2、了解PCR的應(yīng)用領(lǐng)域 二、實(shí)驗(yàn)原理： 1 概念 PCR（Polymerasechain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，對(duì)特定DNA序列進(jìn)行大量擴(kuò)增的一種技術(shù)。 PCR反應(yīng)是以4種dNTP為底物，引物引導(dǎo)，DNA聚合酶催化作用下，在單鏈DNA模板3’末端開(kāi)始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，多次反復(fù)的擴(kuò)增使特定DNA序列以指數(shù)增加。 2、PCR反應(yīng)體系 參與PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為包括：引物、酶、dNTP、Buffer、模板和Mg2+。 2.1 引物 引物是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，兩引物的5’端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)5’末端位置。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。引物設(shè)計(jì)有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng). 引物設(shè)計(jì)一般考慮以下幾個(gè)方面： 2.1.1 引物長(zhǎng)度 PCR特異性一般通過(guò)引物長(zhǎng)度和退火溫度來(lái)控制。 引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18～27bp，最佳為20～24bp。引物過(guò)短時(shí)會(huì)造成Tm值過(guò)低，在酶反應(yīng)溫度時(shí)不能與模板很好的配對(duì)；引物過(guò)長(zhǎng)時(shí)又會(huì)造成Tm值過(guò)高，超過(guò)酶反應(yīng)的最適溫度，還會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。 2.1.2 引物堿基構(gòu)成 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因?yàn)檫@樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。兩個(gè)引物中（g+c）%含量應(yīng)盡量相似，在已知擴(kuò)增片段（g+c）%含量時(shí)宜接近于待擴(kuò)增片段，一般以40%～60%為佳，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。Tm值是一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸互補(bǔ)雙鏈解鏈的溫度。Tm=4（G+C）+2（A+T）。 兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續(xù)6個(gè)以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)模板的同一位點(diǎn)；同樣，引物與待擴(kuò)增目標(biāo)DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個(gè)以上堿基的同源序列。否則，引物就會(huì)與其它位點(diǎn)結(jié)合，使特異擴(kuò)增減少，非特異擴(kuò)增增加。 2.1.3引物二級(jí)結(jié)構(gòu) 引物應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物自身形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等，會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。特別是在引物的3’末端，盡量避免出現(xiàn)這些二級(jí)結(jié)構(gòu)。 2.1.4引物3’端序列 DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸，所以，引物3’端5～6個(gè)堿基與目標(biāo)DNA的配對(duì)要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴(kuò)增。正、反向引物互相不能互補(bǔ)，尤其是在3’末端，否則容易形成引物二聚體。 引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個(gè)堿基的ΔG。?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），負(fù)值大，則3’末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高。引物的3’端的?G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基。 2.1.5引物的5′端 引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。對(duì)于引入一至兩個(gè)酶切位點(diǎn)，應(yīng)在后續(xù)方案設(shè)計(jì)完畢后確定，便于后期的克隆實(shí)驗(yàn)，特別是在用于表達(dá)研究的目的基因的克隆工作中。 2.1.6引物的特異性 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源，特別是與待擴(kuò)增的模板DNA之間要沒(méi)有明顯的相似序列。 2.2 DNA聚合酶 Taq DNA多聚酶是耐熱DNA聚合酶，是從水棲高溫菌（Thermus aquaticus）中分離的，由分子量為109000的一條多肽鏈構(gòu)成。dna聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個(gè)加到3’末端。二是有3’→5’外切酶活力，能識(shí)別和消除錯(cuò)配的引物末端，與復(fù)制過(guò)程中校正功能有關(guān)。三是5’→3’外切酶活力，它能從5’端水解核苷酸，還能經(jīng)過(guò)幾個(gè)核苷酸起作用，切除錯(cuò)配的核苷酸。在體外實(shí)驗(yàn)中，Taq DNA聚合酶的出錯(cuò)率為10-4～10-5。 Taq DNA聚合酶具有以下特點(diǎn)： （1）耐高溫，在70℃下反應(yīng)2小時(shí)后其殘留活性在90%以上，在93℃下反應(yīng)2小時(shí)后其殘留活性是仍能保持60%，而在95℃下反應(yīng)2小時(shí)后為原來(lái)的40%。 （2）在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，故不必在擴(kuò)增反應(yīng)的每輪循環(huán)完成后再加新酶。 （3）一般擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度可達(dá)2.0 kb，且特異性也較高。 一典型的PCR反應(yīng)約需的酶量為2.5u（總反應(yīng)體積為50ml時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。 2.3 dNTP dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200mmol/l， 4種dNTP的濃度要相等。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。 2.4 模板DNA 模板DNA的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。特別是以基因組DNA作為模版時(shí)，DNA提取過(guò)程中未去除干凈的蛋白質(zhì)、糖類、脂類、酚類及各種離子等雜質(zhì)，會(huì)干擾PCR擴(kuò)增反應(yīng)，影響PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量。 模板DNA過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
2.5 Mg2+ 在PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200mmol/l時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/l為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 一般廠商提供的Taq DNA聚合酶均有相應(yīng)的緩沖液，其中已含有一定濃度的Mg2+。在PCR反應(yīng)體系中可以根據(jù)具體情況添加一定量的Mg2+。 3 PCR反應(yīng)流程 PCR循環(huán)過(guò)程包括三部分：模板變性、引物退火、DNA鏈延伸合成。 3.1 模板DNA的變性 模板DNA加熱到90~95℃時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，雙鏈解開(kāi)成為單鏈，以便它與引物結(jié)合。變性溫度低則變性不完全，dna雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度不能過(guò)高，變性時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持taqdna聚合酶的活力。PCR中DNA變性需要的溫度和時(shí)間與模板DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、G-C含量高低等均有關(guān)。G-C間由三個(gè)氫鍵連接，而A-T間只有兩個(gè)氫鍵相連，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對(duì)要高。對(duì)于高G-C含量的模板DNA在實(shí)驗(yàn)中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO），并且在PCR循環(huán)中起始階段進(jìn)行熱啟動(dòng)。 3.2 模板DNA與引物的退火 將反應(yīng)混合物溫度降低至37~65℃時(shí)，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復(fù)合物，即復(fù)性。退火溫度決定PCR產(chǎn)物的特異性與產(chǎn)量。退火溫度高，特異性強(qiáng)，但過(guò)高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；退火溫度低產(chǎn)量高，但過(guò)低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。退火所需要的溫度和時(shí)間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴(kuò)增引物的解鏈溫度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式進(jìn)行計(jì)算：Ta =Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃。在反應(yīng)體系中引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并且引物的長(zhǎng)度顯著短于模板的長(zhǎng)度，因此在退火時(shí)，引物與模板中的互補(bǔ)序列的配對(duì)速度比模板之間重新配對(duì)成雙鏈的速度要快得多。退火時(shí)間一般為1～2min。 3.3 引物的延伸 DNA模板-引物復(fù)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的新鏈。引物延伸溫度的選擇取決于DNA聚合酶的最適溫度, 一般為70～75℃。延伸所需要的時(shí)間取決于模板DNA的長(zhǎng)度。一般在72℃條件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40～60個(gè)堿基/秒,其速度取決于緩沖溶液的組成、ph值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。 PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y＝（1＋X）n計(jì)算。 Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平（Y）均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%。反應(yīng)初期，目的DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)效應(yīng)。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。引物如果跟原始DNA模板結(jié)合，從3'端開(kāi)始擴(kuò)增延伸，其產(chǎn)物的5'端是固定的，3'端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。引物如果是以新合成的DNA鏈（即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”）為模板擴(kuò)增時(shí)，模板的5'端序列是固定位置的，即新合成延伸鏈的3'端是固定的，使新合成DNA鏈的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。由于新合成的DNA鏈在下一個(gè)循環(huán)反應(yīng)中可以作為引物結(jié)合擴(kuò)增的模板，“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加。而原始DNA模版的量是固定的，“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”只按算術(shù)倍數(shù)增加，在最終PCR中的含量幾乎可以忽略不計(jì)。 一般PCR反應(yīng)包括上述變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。但在擴(kuò)增某些較短目標(biāo)序列（長(zhǎng)度為100～300bp時(shí)）時(shí)，可采用二溫度點(diǎn)法，即把退火與延伸溫度合二為一。 3.4 循環(huán)次數(shù) PCR循環(huán)次數(shù)一般為25～40個(gè)。循環(huán)次數(shù)過(guò)多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。 4 PCR反應(yīng)特點(diǎn) 4.1強(qiáng)特異性 PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： （1）引物與模板DNA特異性的結(jié)合； （2）堿基配對(duì)原則； （3）Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； （4）目標(biāo)基因序列的特異性與保守性。 4.2 高靈敏度 在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其靈敏度可達(dá)到白萬(wàn)分之一。 4.3 快速簡(jiǎn)便 PCR反應(yīng)可在PCR儀上進(jìn)行，一般在2～4小時(shí)完成。如采用特殊PCR儀（熒光時(shí)時(shí)定量PCR儀）則可全程監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的結(jié)果，故耗時(shí)將更短。 5 應(yīng)用領(lǐng)域 5.1 PCR技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 5.1.1特定DNA序列的克隆與重組子的鑒定 5.1.2 DNA的體外定點(diǎn)突變與分析 5.1.3染色體DNA的引物原位雜交 5.1.4 DNA洗牌術(shù)（Shuffling） 5.2 PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 5.2.1檢測(cè)病原體 5.2.2臨床疾病診斷 |
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