|
近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基于核酸檢測(cè)的診斷方法已大量建立并廣泛應(yīng)用于人類疾病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)便是其中一種，與其他的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，恒溫?cái)U(kuò)增有快速、高效、特異的優(yōu)點(diǎn)且無(wú)需專用的設(shè)備，所以它一經(jīng)出現(xiàn)就被許多學(xué)者認(rèn)為是一種有可能與PCR媲美的檢測(cè)方法。當(dāng)前常見(jiàn)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、依賴解旋酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、依賴核酸序列等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和核酸快速等溫檢測(cè)放大等技術(shù)。為了更好地有選擇地開(kāi)發(fā)利用這方面技術(shù)，現(xiàn)就這些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP )
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增其擴(kuò)增原理是基于DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈，在此前提下利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，以外側(cè)引物區(qū)段的3`末端末端為起點(diǎn)，與模板DNA互補(bǔ)序列配對(duì)，啟動(dòng)鏈置換DNA合成。
（1）擴(kuò)增效率高，能夠在1h內(nèi)有效的擴(kuò)增1-10拷貝的目的基因，擴(kuò)增效率是普通PCR的10倍-100倍（2）反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備
（2）擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于克隆測(cè)序，只能用于判斷（3）由于其敏感性強(qiáng)，特別容易形成氣溶膠，造成假陽(yáng)性影響檢測(cè)結(jié)果
依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù) (NASBA)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，是由1對(duì)帶有T7啟動(dòng)子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù)、等溫、基于酶反應(yīng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)在41℃進(jìn)行，可以在2h左右將模板RNA擴(kuò)增約109倍，比常規(guī)PCR法高1000倍，不需特殊的儀器。
該技術(shù)一出現(xiàn)就被用于疾病的快速診斷和病人血清中HIV-1的定量檢測(cè)。盡管RNA的擴(kuò)增也可以使用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（通過(guò)反轉(zhuǎn)錄形成單鏈DNA模板),NASBA相比則有自己的優(yōu)勢(shì)：可以在相對(duì)恒溫的條件下進(jìn)行（一般恒溫為41攝氏度）。該技術(shù)用于醫(yī)學(xué)診斷，相對(duì)傳統(tǒng)的PCR技術(shù)更為穩(wěn)定，準(zhǔn)確。
（1）它的引物上帶有T7啟動(dòng)子序列，而外來(lái)雙鏈DNA無(wú)T7啟動(dòng)子序列，不可能被擴(kuò)增，因此該技術(shù)具有較高的特異性和靈敏度。（2）NASBA將反轉(zhuǎn)錄過(guò)程直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中，縮短了反應(yīng)時(shí)間。（3）對(duì)DNA病毒的檢測(cè)上NASBA就顯得不是那么適合
滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù) (RCA) 1998 年建立的滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA) 是模擬自然界微生物環(huán)狀 DNA 的滾環(huán)復(fù)制過(guò)程，發(fā)展起來(lái)的一種放大信號(hào)和靶核酸相結(jié)合的檢測(cè)方法。在具有鏈置換活性的 DNA 聚合酶作用下由一條引物與環(huán)形 DNA 模板的鏈置換合成，實(shí)現(xiàn)環(huán)狀 DNA 模板的體外等溫線性擴(kuò)增?？煞譃榫€性擴(kuò)增 (單引物 RCA)、指數(shù)擴(kuò)增、多引物擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增RCA。這種方法不僅可以直接擴(kuò)增DNA和RNA，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的信號(hào)放大，靈敏度達(dá)到一個(gè)拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。
（1）高靈敏度，RCA有很強(qiáng)的擴(kuò)增能力，線性RCA的效率可達(dá)到105倍，而指數(shù)RCA的效率可達(dá)到109倍，具有檢測(cè)單拷貝的潛力。（2）高序列特異性，可以區(qū)分單一位點(diǎn)的不同模式（3）擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)磷酸化處理后可直接用來(lái)測(cè)序（4）高通量，RCA可以在靶目標(biāo)上形成閉合的環(huán)狀序列，確保RCA產(chǎn)生的信號(hào)集中在一點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)原位擴(kuò)增和載片擴(kuò)增。（1）瑣式探針常接近100bp,合成費(fèi)用較高。（2）信號(hào)檢測(cè)時(shí)存在背景干擾問(wèn)題
單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SPIA) SPIA的核心是一條混合引物及可以切割DNA/RNA雜合鏈中RNA部分的RNA酶，由3'端DNA部分和5'端RNA部分組成。在反應(yīng)過(guò)程中，RNaseH不斷降解引物區(qū)DNA/RNA雙鏈中的RNA部分，暴露出模板上與引物RNA部分結(jié)合的位點(diǎn)，然后新引物結(jié)合上去進(jìn)行鏈置換合成，經(jīng)過(guò)RNA降解、新引物結(jié)合、鏈置換的循環(huán)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)模板互補(bǔ)序列的快速擴(kuò)增。
依賴解旋酶 DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (HDA) 依賴解旋酶 DNA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (HDA) 是美國(guó)NEB 公司于 2004 年發(fā)明的一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)模擬體內(nèi) DNA 復(fù)制的自然過(guò)程，利用解旋酶在恒溫下解開(kāi) DNA 雙鏈，再由 DNA 單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定已解開(kāi)的單鏈為引物提供模板，然后在 DNA 聚合酶的作用下合成互補(bǔ)的雙鏈，繼而不斷重復(fù)上述循環(huán)擴(kuò)增過(guò)程，最終實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)式增長(zhǎng)。
RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37°C左右。常規(guī)PCR必須經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設(shè)備。RPA反應(yīng)的zui適溫度在37℃-42℃之間，無(wú)需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無(wú)疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。 
鏈替代擴(kuò)增 (SDA) 技術(shù)是基于在靶DNA兩端帶有被化學(xué)修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，核酸內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)將鏈DNA打開(kāi)缺口，DNA聚合酶延伸缺口3`端并替代下一條DNA鏈。被替代下來(lái)的DNA單鏈可與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過(guò)程不斷反復(fù)進(jìn)行，使靶序列被高效擴(kuò)增。SDA的基本系統(tǒng)包括一種限制性內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、兩對(duì)引物、dNTP以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。
SDA的優(yōu)點(diǎn)：
（1）擴(kuò)增效率高
（2）反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備
SDA的不足：
（1）SDA產(chǎn)物不均一，在SDA循環(huán)中總要產(chǎn)生一些單、雙鏈產(chǎn)物，用電泳法檢測(cè)時(shí)必然要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。
（2）SDA產(chǎn)物不可能直接用于克隆、測(cè)序和表達(dá)
（3）SDA產(chǎn)物的檢測(cè)手段有待提高，目前主要的方法是熒光偏振檢測(cè)，需要用到熒光分光分光光度計(jì)，這限制了SDA在臨床的廣泛應(yīng)用。
參考資料：資料整理自互聯(lián)網(wǎng)
|
