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熱啟動(dòng)PCR常用于增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性。熱啟動(dòng)PCR主要借助一種酶的修飾物（如抗體、親和配體、適體或化學(xué)修飾物）來(lái)抑制常溫下DNA聚合酶的活性。這種修飾使得在PCR反應(yīng)體系配制階段引物與模板、引物與引物之間的結(jié)合能力降低，從而避免了非特異性擴(kuò)增。由于DNA聚合酶在常溫下的活性被抑制，熱啟動(dòng)技術(shù)為在常溫下配制多個(gè)PCR反應(yīng)體系提供了極大的便利，而無(wú)需犧牲PCR反應(yīng)的特異性。

當(dāng)反應(yīng)體系配制好后，在反應(yīng)初始加熱步驟，酶修飾物在高溫下（通常高于90 ℃）被釋放，使得DNA聚合酶被激活（圖1）。激活時(shí)間和溫度根據(jù)DNA聚合酶及熱啟動(dòng)修飾物的不同而有所差別。對(duì)于某些聚合酶，激活和預(yù)變性合并成了一步。

圖1. 基于抗體熱啟動(dòng)技術(shù)的DNA聚合酶

另一種提升PCR反應(yīng)特異性的方法是調(diào)整PCR循環(huán)的參數(shù)。在降落PCR中，前幾個(gè)循環(huán)的退火溫度設(shè)定為比引物的最高退火溫度（Tm）再高幾度[1,2]。較高的溫度有助于避免產(chǎn)生引物二聚體及非特異性引物與模板形成的復(fù)合物，因此可以減少不希望出現(xiàn)的擴(kuò)增。就這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，較高的退火溫度可減少非特異性PCR產(chǎn)物，在PCR起始階段促進(jìn)特異性的擴(kuò)增。

雖然較高的退火溫度可阻止引物二聚體形成和非特異性引物結(jié)合，但同時(shí)較高的退火溫度會(huì)加劇引物與目標(biāo)序列的分離，導(dǎo)致PCR的產(chǎn)量降低。為了克服這個(gè)問(wèn)題，在開(kāi)始的幾個(gè)循環(huán)中，退火溫度通常設(shè)置為每個(gè)循環(huán)降低1℃，以獲得足量的預(yù)期擴(kuò)增子。當(dāng)退火溫度降低到最佳溫度時(shí)（通常比最低的引物Tm低3-5℃），剩余的循環(huán)都維持此退火溫度。通過(guò)這種方法，在PCR過(guò)程中，所期望的PCR產(chǎn)物得到有選擇性的增加，而幾乎不會(huì)出現(xiàn)非特異性的產(chǎn)物（圖2）。

圖2. 降落PCR。通過(guò)以較高的溫度起始，再隨著循環(huán)逐漸降低到最佳退火溫度（黑色曲線(xiàn)），這種PCR方法可提升反應(yīng)特異性（黃色曲線(xiàn)）。目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量（綠色曲線(xiàn)）相應(yīng)的得到富集。

巢式PCR是常規(guī)PCR的一種演變，其增強(qiáng)了反應(yīng)特異性和目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量。在此方法中，需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：一對(duì)（外引物）在目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域的側(cè)翼，而另一對(duì)引物（巢式引物）對(duì)應(yīng)于所擴(kuò)增DNA的準(zhǔn)確區(qū)域。第一輪PCR的產(chǎn)物之后作為第二輪PCR的模板（圖3）。圖3. 巢式PCR

如果第一對(duì)引物（外引物）由于引物錯(cuò)配擴(kuò)增出了非特異性產(chǎn)物，第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低，所以通過(guò)第二對(duì)引物的擴(kuò)增，PCR的特異性得到了提升。進(jìn)行兩輪PCR的另一個(gè)好處是這種方法有助于從有限的起始DNA中擴(kuò)增得到足量的產(chǎn)物。

在快速PCR中，通過(guò)縮減PCR步驟所需的時(shí)間來(lái)完成更快的擴(kuò)增，而不影響擴(kuò)增產(chǎn)量和效率?？焖傺h(huán)條件尤其適用于均有高擴(kuò)增能力的DNA聚合酶，這種聚合酶在每次結(jié)合中可引入更多的核苷酸。高擴(kuò)增能力的聚合酶可保持高擴(kuò)增效率，而PCR延伸時(shí)間是Taq聚合酶（低擴(kuò)增能力）延伸時(shí)間的1/2到1/3（圖4）。通過(guò)將引物退火和延伸（如果溫度僅相差幾度）合并成一步，PCR反應(yīng)時(shí)間可進(jìn)一步縮短。這個(gè)方案也被稱(chēng)為兩步PCR方案。

圖4. 低擴(kuò)增能力和高擴(kuò)增能力的DNA聚合酶擴(kuò)增3.8 kb人類(lèi)gDNA片段的效果對(duì)比。使用兩步PCR方案（退火和延伸步驟合并）。

當(dāng)使用低擴(kuò)增能力的DNA聚合酶（如Taq酶）擴(kuò)增<500>

另一種快速PCR的調(diào)整方法為縮短變性時(shí)間，將溫度升高到98℃。使用這種策略需要注意的是，不是高度熱穩(wěn)定的聚合酶在如此高溫下容易變性。

直接PCR意指直接從樣本中擴(kuò)增目的DNA，而無(wú)需核酸純化。直接PCR中，在高溫變性階段，諸如細(xì)胞、組織等材料在獨(dú)特的緩沖液中裂解，釋放出DNA。因此這種方法簡(jiǎn)化了PCR實(shí)驗(yàn)流程，減少了動(dòng)手操作的時(shí)間，同時(shí)可避免純化步驟中DNA的損失（圖5）。圖 5. 常規(guī)PCR與直接PCR對(duì)比。

推薦具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR擴(kuò)增。細(xì)胞碎片、蛋白、脂質(zhì)和多糖也隨DNA釋放到裂解液中，它們會(huì)抑制PCR反應(yīng)。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受這些抑制劑，從而使直接PCR成為可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高靈敏度，因此可從未純化樣本中擴(kuò)增微量的DNA。

具有高GC含量（>65%）的模板由于G和C堿基間的強(qiáng)氫鍵影響，比較難以擴(kuò)增。高GC含量序列同時(shí)也涉及二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，高GC含量序列可使DNA聚合酶在擴(kuò)增時(shí)卡住，從而影響了DNA的合成。

為了擴(kuò)增高GC含量片段，雙鏈模板必須分離，以便引物結(jié)合及DNA聚合酶讀取序列。為了克服強(qiáng)GC相互作用，最常用的方法是依靠PCR添加劑或共溶劑來(lái)幫助DNA變性（圖6A），如DMSO。這些試劑通常會(huì)降低引物的Tm，所以退火溫度也需做相應(yīng)的調(diào)整。

高合成能力的DNA聚合酶由于其與模板的強(qiáng)結(jié)合能力，有助于高GC含量模板的PCR擴(kuò)增（圖6B）。高熱穩(wěn)定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR擴(kuò)增，因?yàn)楦叩淖冃詼囟龋ㄈ?8℃代替95℃）可促進(jìn)解鏈和PCR擴(kuò)增。

圖 6. 擴(kuò)增不同GC含量的人類(lèi)gDNA片段。（A）使用低合成能力的DNA聚合酶擴(kuò)增0.8 kb 76% GC含量的片段。DMSO量的增加有助于提高擴(kuò)增特異性。（B）使用高合成能力的DNA聚合酶擴(kuò)增7個(gè)不同GC含量的片段。僅在擴(kuò)增70%和76% GC含量片段時(shí)使用GC增強(qiáng)劑。

多重PCR可實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)不同的片段。多重PCR不僅意味著節(jié)約時(shí)間、試劑和樣本，同時(shí)使得多個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行同時(shí)比較成為可能。

圖 7. 單個(gè)PCR與多重PCR的比較。在單個(gè)PCR中，每個(gè)反應(yīng)含有一個(gè)引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增一個(gè)目的片段。在多重PCR中，在同一個(gè)反應(yīng)中使用多個(gè)引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增多個(gè)目的片段。

當(dāng)一個(gè)反應(yīng)管中存在多個(gè)引物對(duì)時(shí)，如在多重PCR中，非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增效率的降低是最關(guān)注的問(wèn)題，因?yàn)榉磻?yīng)的優(yōu)化不可能針對(duì)所有的引物對(duì)和片段。因此，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，以減少錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增。引物序列對(duì)于目標(biāo)片段應(yīng)該是獨(dú)特的，且所有引物的Tm值差異應(yīng)在5℃內(nèi)。在進(jìn)行多重PCR前，每個(gè)引物對(duì)應(yīng)在單個(gè)反應(yīng)中驗(yàn)證其特異性和擴(kuò)增效率。而且，不同大小的擴(kuò)增子應(yīng)在凝膠電泳中可區(qū)分開(kāi)，以便鑒定。除了引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增子大小，熱啟動(dòng)DNA聚合酶和特殊優(yōu)化的PCR緩沖液對(duì)于多重PCR也是必需的，它們可有助于擴(kuò)增的成功率和擴(kuò)增的特異性。

圖 8. 通過(guò)凝膠電泳比較單個(gè)PCR和多重PCR。此實(shí)驗(yàn)中使用Invitrogen? Platinum? Multiplex PCR Master Mix。

雖然多重PCR通常用于終點(diǎn)法PCR，但由于其在多重標(biāo)記和檢測(cè)中的能力，將其用于實(shí)時(shí)定量PCR也變得越來(lái)越流行。多重實(shí)時(shí)定量PCR也常用于遺傳標(biāo)志物的檢測(cè)，用于身份鑒定。

長(zhǎng)片段PCR通常指擴(kuò)增大于5 kb的DNA片段。長(zhǎng)片段PCR傳統(tǒng)上使用Taq DNA聚合酶（為了快速延伸）和高保真酶（為了準(zhǔn)確度）的混合物。

隨著高合成能力、高保真DNA聚合酶的發(fā)明，長(zhǎng)片段PCR現(xiàn)在可在短時(shí)間內(nèi)高準(zhǔn)確性的完成。通過(guò)與一個(gè)強(qiáng)DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合，聚合酶可獲得高擴(kuò)增能力，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增長(zhǎng)片段（如>20 kb gDNA片段）（圖9）。初次之外，極高保真度（如>100xTaq）可確保長(zhǎng)片段擴(kuò)增的低錯(cuò)誤率（表3）。

圖 9. 使用高合成能力DNA聚合酶進(jìn)行長(zhǎng)片段擴(kuò)增，從人類(lèi)gDNA樣本中擴(kuò)增15 kb和30 kb的特異性片段。

當(dāng)擴(kuò)增>10 kb的片段時(shí)，PCR實(shí)驗(yàn)方案可能需要在以下5個(gè)關(guān)鍵位置進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化：

1. 確保使用高質(zhì)量、高純度的DNA樣本。

2. 如果DNA聚合酶的熱穩(wěn)定較低，使用更多量的DNA聚合酶以彌補(bǔ)多次循環(huán)中的聚合酶活性損失。

3. 降低退火和延伸步驟的溫度，以助于引物結(jié)合。

4. 適當(dāng)增加PCR步驟的時(shí)間，以促進(jìn)模板DNA的完全分離及引物的結(jié)合。

5. 適當(dāng)增加PCR延伸時(shí)間確保目的片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增。

反向PCR（Inverse PCR）

反向PCR起初設(shè)計(jì)用于確定臨近未知區(qū)域的序列。反向PCR有助于研究一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列；致癌染色體重排如基因融合、異位或轉(zhuǎn)移；及病毒基因的整合。之所以稱(chēng)為反向PCR，是因?yàn)橐镌O(shè)計(jì)用于向兩邊延伸而不像常規(guī)PCR中朝著彼此延伸[4,5]。如今，反向PCR常用于定點(diǎn)突變，復(fù)制一個(gè)具有預(yù)期突變的目的質(zhì)粒。

在研究基因組DNA未知序列的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)流程中，限制性?xún)?nèi)切酶消化和連接先于反向PCR，接著對(duì)PCR擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于gDNA消化，需選擇一種限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切以獲得合適長(zhǎng)度可自連的片段。同時(shí)，所選擇的內(nèi)切酶不應(yīng)該切割已知序列，所以連接發(fā)生于側(cè)翼的未知序列之間。使用低濃度的酶切DNA片段以助于片段自連而非多個(gè)片段連接。

片段自連完成后，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增DNA的位置區(qū)域。獲得的擴(kuò)增子兩端包含一部分已知序列。之后通過(guò)測(cè)序以鑒定臨近已知序列的未知區(qū)域。

圖 10. 使用反向PCR來(lái)擴(kuò)增和鑒定臨近未知區(qū)域序列。

定量PCR（Quantitative PCR）

由于序列擴(kuò)增的產(chǎn)量依賴(lài)于模板DNA的量，所以PCR常用于對(duì)樣品中DNA進(jìn)行定量，常用的應(yīng)用是基因表達(dá)的定量。終點(diǎn)法PCR是一種可能的方法，但其有較大的缺點(diǎn)，通過(guò)凝膠電泳來(lái)檢測(cè)產(chǎn)量，檢測(cè)的靈敏度非常有限。更重要的是，使用終點(diǎn)PCR是在PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行定量，此時(shí)擴(kuò)增已經(jīng)達(dá)到平臺(tái)期（圖11），DNA凝膠染色的強(qiáng)度與DNA起始量不成線(xiàn)性關(guān)系。盡管如此，通過(guò)終點(diǎn)法PCR可以對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行半定量，可以使用一系列稀釋程度不同的DNA樣本作為模板起始量，或者在特定的PCR循環(huán)處獲取擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過(guò)凝膠顯色強(qiáng)度來(lái)估計(jì)基因的表達(dá)量。

圖 11. PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)或反映動(dòng)力學(xué)。在終點(diǎn)PCR中，擴(kuò)增子的檢測(cè)是在反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)期以后。在實(shí)時(shí)定量PCR中，擴(kuò)增子的檢測(cè)是在反應(yīng)的指數(shù)期。

在1993年當(dāng)Higuchi et al.發(fā)明使用熒光信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)模擬PCR擴(kuò)增，基于終點(diǎn)法PCR定量的局限性得到克服解決。這種技術(shù)成為我們今天熟知的定量PCR的基礎(chǔ)。1997年，首款qPCR儀器上市，使得可以發(fā)揮PCR的力量來(lái)準(zhǔn)確定量基因的表達(dá)和拷貝數(shù)。qPCR依靠在對(duì)數(shù)期通過(guò)熒光強(qiáng)度來(lái)實(shí)時(shí)模擬目標(biāo)基因的擴(kuò)增（圖11），避免了終點(diǎn)PCR定量的缺點(diǎn)。當(dāng)qPCR用于基因表達(dá)的相對(duì)和絕對(duì)定量，由于檢測(cè)能力有限，其仍然具有一定的局限性。

數(shù)字PCR的發(fā)明使得對(duì)DNA樣本的絕對(duì)定量成為可能[11-13]。在數(shù)字PCR中，高度稀釋的DNA樣本被分散在多孔芯片中，使得每孔含不超過(guò)一個(gè)拷貝的目的基因。每孔內(nèi)擴(kuò)增的結(jié)果檢測(cè)為陽(yáng)性或陰性。通過(guò)使用統(tǒng)計(jì)模型（泊松分布）分析陰性反應(yīng)的比例，從而來(lái)決定樣本的拷貝數(shù)，無(wú)需已知樣本作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行定量（圖12）。除了基因表達(dá)和拷貝數(shù)檢測(cè)，數(shù)字PCR也適用于諸如低頻等位基因的辨別、病毒滴定和二代測(cè)序文庫(kù)的絕對(duì)定量。

圖 12. 數(shù)字PCR常用實(shí)驗(yàn)流程，用于絕對(duì)定量。

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總的來(lái)說(shuō)，改進(jìn)的PCR方法和改進(jìn)的DNA聚合酶是為了提高PCR擴(kuò)增的結(jié)果。雖然PCR的基礎(chǔ)概念仍然沒(méi)變，但新的PCR方法一直在推動(dòng)和簡(jiǎn)化分子生物學(xué)研究。

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