目前包括單克隆抗體和Fc融合蛋白在內(nèi)的幾種治療蛋白已成為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和其他風(fēng)濕性疾病患者重要的治療手段（表1），這些生物療法對許多患者的疾病進程有重大影響。針對風(fēng)濕性疾病不同途徑的各種新型生物制劑正在開發(fā)中，今后生物治療的選擇將會更多，然而生物治療的成本限制了許多患者獲得這些治療機會。

表1 批準(zhǔn)用于風(fēng)濕性疾病的治療蛋白

《患者保護和平價醫(yī)療法案》中的《生物制品價格競爭與創(chuàng)新法案（2009）》為被證明是與以前批準(zhǔn)的FDA許可的生物制劑（稱為參考產(chǎn)品）相似或可互換的藥物建立了一個便捷的途徑，有望改善風(fēng)濕性疾病等生物藥物的使用。雖然1984年建立了“通用”藥物（通常是小分子物質(zhì)）的便捷路徑，但在《藥物價格競爭法》和《專利期限恢復(fù)法》（“公法98-417”，又稱“Hatch-Waxman法”）中，此立法僅適用于與經(jīng)批準(zhǔn)的藥物具有“相同”活性成分并有效復(fù)制的藥物。由于生物制劑及其制造過程的復(fù)雜性，任何給定的藥物不同批次之間都存在差異性，因此盡管結(jié)構(gòu)和功能極其相似，兩種生物制劑也不可能完全相同。這一因素向《生物制品價格競爭和創(chuàng)新法案》（BPCI法案）的實施科學(xué)和監(jiān)管方面提出了新的挑戰(zhàn)。

BPCI法案中定義“生物相似性”為“高度相似于原研藥參比品的生物制品，盡管其在臨床應(yīng)用的無活性成分中有微小差異”，并且“生物類似藥和參比藥兩者之間在臨床應(yīng)用的安全性、純度和效價方面不存在顯著差異?！盕DA指南文件《證明與參照藥具有生物相似性的科學(xué)考慮要點和《證明與參照藥具有生物相似性的質(zhì)量注意事項》闡述了生物學(xué)相似性的重要科學(xué)準(zhǔn)則和FDA對申請人（sponsors）的建議。很多科學(xué)的挑戰(zhàn)都與生物仿制藥產(chǎn)品開發(fā)相關(guān)，F(xiàn)DA可利用豐富的經(jīng)驗來審查產(chǎn)品內(nèi)部成分制造的變更，包括復(fù)雜的新型生物制劑的可比性數(shù)據(jù)。

FDA會對申請人提供的臨床或非臨床研究中的生物仿制藥的所有數(shù)據(jù)進行分析，并建議在生物相似藥研發(fā)中使用階梯式方法論證，包括生物仿制藥和參比藥之間大量全面的結(jié)構(gòu)和功能信息比較數(shù)據(jù)，這也是仿制藥研究項目的基礎(chǔ)。臨床研究中評估藥代動力學(xué)（PK）和藥效相似性（PD）是生物相似藥評估的重要組成部分。非臨床數(shù)據(jù)可由體外藥理學(xué)研究提供，如果需要還可以進行動物毒性研究。值得注意的是，生物仿制藥發(fā)展計劃的目的不是為了建立生物仿制藥的安全性和有效性評估體系，因為參比藥已經(jīng)證明了這一點，而是論證其與參比藥之間的生物相似性。因此，應(yīng)設(shè)計任何其他臨床安全性和有效性研究，包括免疫原性測試，以評估擬議的生物仿制藥與參比藥之間是否存在臨床意義上的差異。在此我們概述了FDA評估分析相似性的方法，并描述了臨床研究設(shè)計的考慮因素，以支持RA生物仿制藥的應(yīng)用。這種方法在2016年FDA批準(zhǔn)的三類藥物中有所體現(xiàn)：英夫利昔單抗（infliximab-dyyb ，Inflectra?，Hospira公司，美國），一種與美國授權(quán)的Remicade?（Centocor公司）相似的生物仿制藥；依那西普生物類似藥（erelzi?，Sandoz公司，美國），一種與美國授權(quán)的Enbrel? （Amgen公司）相似的生物仿制藥；阿達木單抗（adalimumab-atto，amjevita?，Amgen公司，美國），一種與美國授權(quán)的Humira?（Abbvie公司）相似的生物仿制藥。

相似性分類

實現(xiàn)生物相似性首先要證明生物仿制藥和參比藥非常相似，在FDA審查生物制劑許可證（BLA）申請時，最終相似性的確定還要排除臨床非活性成分的微小差異。生物類似藥的發(fā)起人可提前在藥物開發(fā)前期提交分析數(shù)據(jù)，F(xiàn)DA在審查這些數(shù)據(jù)時可能會將整個連續(xù)的開發(fā)過程分為四個類別：“不相似”，分析相似性不足，在通過《公共健康服務(wù)法（PHS法案）》351（k）調(diào)節(jié)途徑進一步開發(fā)之前就需要修改制造過程中產(chǎn)品表現(xiàn)出來的不同特性；“相似”，殘留有不確定性的分析相似性，需要進一步從其他研究或分析中獲取信息以確定其差異是否確實在可接受范圍內(nèi)（例如，糖基化差異，在藥代動力學(xué)中十分重要）；“高度相似”，暫定分析相似性，比較分析表征結(jié)果顯示擬議的生物仿制藥符合分析相似性的法定標(biāo)準(zhǔn)，可通過有針對性和選擇性的動物和/或臨床研究將解決殘存的不確定性；“指紋級相似”，擬議的生物仿制藥符合基于多參數(shù)綜合分析法分析相似性的法定標(biāo)準(zhǔn)，在確定分析差異方面極其靈敏，任何殘存的差異都可通過進一步有針對性的動物或臨床研究解決。

FDA評估發(fā)生在研發(fā)階段的連續(xù)過程中，其比較分析表征的結(jié)果應(yīng)揭示生物相似性證明的后續(xù)步驟。開發(fā)初期，由于各種原因，擬議的生物仿制藥可能被確定為“相似”。例如，仿制藥與參比藥的生物化學(xué)，生物物理學(xué)和生物學(xué)特性看起來非常相似，但是被評估的多批次生物仿制藥或參比藥的數(shù)量不足，此時就需要額外提供表征數(shù)據(jù)證明仿制藥與參比藥始終保持高度相似。其次，若仿制藥與參比藥存在細微差異，則需要進一步表征或從科學(xué)文獻中尋找數(shù)據(jù)支持，即便這樣，F(xiàn)DA還要求進一步研究來判斷仿制藥是否與參比藥高度相似。

開發(fā)早期，若分析表證結(jié)果顯示仿制藥與參比藥“高度相似”或“指紋級相似”，便可考慮通過臨床/非臨床開發(fā)計劃進行有有選擇有針對性的研究進一步證明整體的生物相似性。對生物仿制藥的分析研究應(yīng)貫穿整個開發(fā)階段，以確保在臨床研究和商業(yè)大批量制造過程中不同生產(chǎn)批次高度相似。

圖1 生物仿制藥產(chǎn)品開發(fā)概述

生物仿制藥開發(fā)應(yīng)首先搜索參比藥，已知生物學(xué)的公開信息及其目標(biāo)。參比藥的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，翻譯后修飾和生物活性應(yīng)由生物仿制藥申請人進行分析，以確定產(chǎn)品概況。表達系統(tǒng)（表達構(gòu)建體和宿主細胞系）的開發(fā)和制造過程為生物相似性提供依據(jù)。若開發(fā)初期數(shù)據(jù)分析顯示生物仿制藥與參比藥“高度相似”，那么可有選擇有針對性的進行臨床測試。

分析相似性研究中使用正交分析方法來評估質(zhì)量屬性，這種方法會對蛋白質(zhì)的一級、二級及更高級的結(jié)構(gòu)進行評估，全面分析翻譯后修飾、脫酰胺作用、氧化及氨基修飾作用等影響分子的功能、安全性和穩(wěn)定性的各種潛在因素，例如，加入聚乙二醇，檢測分子大小、所帶電荷及其生物活性。如果某個分子在多方面表現(xiàn)出生物活性，則需要在可行情況下確保各方面都與參比藥保持高度相似，特別是在特殊作用機制或者作用機制尚不明確的情況下。

評估分析的設(shè)計是開發(fā)生物仿制藥的第一步（圖1),了解分子結(jié)構(gòu)與功能及基本生物學(xué)特征，結(jié)合指定目標(biāo)進一步選擇確定相關(guān)方法。申請人對不同批次參比藥的分析可用于建立仿制藥相關(guān)屬性的定量分析標(biāo)準(zhǔn)。開發(fā)初期，進行臨床或非臨床研究之前，仿制藥的擴大生產(chǎn)應(yīng)該是迭代的，盡可能達到高度相似。

批準(zhǔn)用于風(fēng)濕病的大多數(shù)治療性蛋白質(zhì)是單克隆抗體，這些單克隆抗體具有特異性，特別是抗體多聚糖亞型對藥代動力學(xué)和生物學(xué)功能的影響是眾所周知的。因此，接下來介紹如何評估單克隆抗體的分析相似性，這種方法對其他一些仿制藥同樣適用。

治療性單克隆抗體的作用機制抗體免疫介導(dǎo)的效應(yīng)功能，包括抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性反應(yīng)（ADCC）、補體依賴性細胞毒性反應(yīng)（CDC）、抗體依賴性細胞吞噬作用和Fc介導(dǎo)的細胞凋亡。附著在重鏈CH2區(qū)（圖2）的天冬酰胺殘基抗體聚糖可激活Fcγ受體和補體C1，特異性聚糖結(jié)構(gòu)（圖2）對補體依賴性和抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性至關(guān)重要。

核糖七糖含有N-乙酰氨基葡萄糖和甘露糖殘基,添加的半乳糖，巖藻糖和唾液酸具有異質(zhì)性，但是這些單糖的存在可改變單克隆抗體的藥代動力學(xué)特征及其功能。例如，每個恒定區(qū)域聚糖結(jié)構(gòu)可分別含有一個或兩個G0，G1和G2半乳糖殘基，增加G0聚糖水平可降低補體依賴性細胞毒性。

由于單克隆抗體聚糖上的巖藻糖和Fcγ受體IIIa（FcγRIIIa）聚糖之間相互作用，親和力降低，因此可抑制自然殺傷（NK）細胞等抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用。而巖藻糖對其他效應(yīng)細胞抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用影響較小，因為它對FcγR家族以外成員沒有影響，而NK細胞僅表達FcγRIII和FcγRIIC，細胞骨髓和粒細胞譜系則可表達FcγR家族成員中的大多數(shù)?？茖W(xué)研究表明糖基化的單克隆抗體可通過增強與FcγRIIIa的結(jié)合能力改善多個FcγR家族成員細胞的效應(yīng)功能。因此，通過對補體依賴性和抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用進行測定可解決半乳糖和巖藻糖水平的差異。文獻表明，巖藻糖基化對抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用影響最大，半乳糖基化對補體依賴性細胞毒作用影響最大，此外含有半乳糖和唾液酸單糖的特異性聚糖結(jié)構(gòu)也可增強補體依賴性或抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用。

圖2 生物仿制藥的細胞毒性抗體結(jié)構(gòu)的重要特點

A.IgG抗體基本結(jié)構(gòu)包含可變區(qū)和恒定區(qū)的輕鏈和可變區(qū)，鉸鏈區(qū)和三恒域的重鏈，分別具有不同的功能。聚糖與CH2結(jié)構(gòu)域中Asn297相連接。

B.抗體聚糖為含有四個N-乙酰氨基葡萄糖和三個甘露糖殘基的核心七糖。人抗體可能含有平分型N-乙酰氨基葡萄糖，這種結(jié)構(gòu)在其他物種中不常見。巖藻糖和半乳糖殘基的加入呈現(xiàn)異質(zhì)性。唾液酸僅在半乳糖的結(jié)構(gòu)上添加。

不完全處理的高甘露糖形式比含有核糖七糖和其它末端單糖的單克隆抗體清除得更快。高甘露糖形式水平的差異可通過藥代動力學(xué)研究進行評估。其中Fc融合蛋白或其它治療性蛋白非Fc部分被糖基化，其藥代動力學(xué)性質(zhì)可被不同類型的聚糖結(jié)構(gòu)改變。

開發(fā)生物仿制糖蛋白時應(yīng)考慮培養(yǎng)條件和宿主細胞底物對仿制藥終產(chǎn)品中單克隆抗體聚糖變體類型的影響，來自不同物種的細胞系通過典型的非均相加成半乳糖，巖藻糖和唾液酸合成核心七糖，在治療性單克隆抗體的小鼠和倉鼠細胞系中這些殘基的量有所不同。植物細胞培養(yǎng)基也可合成單克隆抗體基本糖鏈結(jié)構(gòu)，可使用不同的連接鍵加入一些末端糖，且可補充未被哺乳動物細胞底物使用的木糖，生物仿制藥與糖的新型組合，是不太可能被視為“高度相似”的。

抗體糖鏈異構(gòu)水平可通過功能測定進行定量和評估，但無法解釋體外和體內(nèi)這些異構(gòu)體之間差異的相關(guān)性。若仿制藥和參比藥功能測定和FcγR結(jié)合力顯示不同的結(jié)果，則仿制藥在體內(nèi)的作用將存在殘留的不確定性。此外，對于任何給定的適應(yīng)癥，不同F(xiàn)cγRs和效應(yīng)細胞類型對應(yīng)的不同效應(yīng)功能尚不十分明確，因此應(yīng)確保這些特征與參比藥高度相似。

生物仿制藥早期發(fā)展計劃主要涉及表達構(gòu)建的設(shè)計，克隆細胞系的開發(fā)，細胞培養(yǎng)條件和純化過程的優(yōu)化以及對多批次仿制藥和參比藥的分析，以確保仿制藥與參比藥保持“高度相似”。

臨床研究旨在解決數(shù)據(jù)中殘留的不確定性，排除與參比藥相比可能導(dǎo)致臨床后果的結(jié)構(gòu)和功能差異，治療蛋白性質(zhì)的復(fù)雜性決定了仿制藥的不確定性，不可能與參比藥完全一樣，目前可用先進的分析方法評估不同程度的殘留不確定性。

臨床研究應(yīng)針對這些不確定因素進行評估，而不單單是為了建立生物仿制藥的安全性和有效性評價體系，這正是藥物開發(fā)的新范式。為了證明生物仿制藥和參比藥之間沒有臨床上的差異，通常要進行人體藥物動力學(xué)（PK）和藥效學(xué)（PD）數(shù)據(jù)以及臨床免疫原性評估，需要額外的臨床安全性和有效性數(shù)據(jù)評估導(dǎo)致殘留不確定性的其他因素，例如對作用機制和疾病病理學(xué)的了解，藥代動力學(xué)和藥效學(xué)結(jié)果臨床結(jié)果預(yù)測相關(guān)性，臨床經(jīng)驗，參比藥及其治療類別，風(fēng)險收益情況，仿制藥應(yīng)用相關(guān)臨床經(jīng)驗等。

正如FDA草案指南中詳述，臨床藥理學(xué)研究是階梯式方法驗證生物相似性的關(guān)鍵。這些研究設(shè)計得好的話便能有效評價生物仿制藥和參比藥之間藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特征的相似性，此外應(yīng)說明是否需要額外的臨床研究來解決任何殘留不確定性以及如何設(shè)計臨床研究方案。

某些情況下，人體藥效學(xué)數(shù)據(jù)可能會為生物相似性測定提供有力的證據(jù)。 例如，在FDA的351（k）途徑下批準(zhǔn)的第一個生物相似藥非格司亭仿制藥（粒細胞集落刺激藥，filgrastim-sndz）的開發(fā)計劃中，對健康志愿者進行臨床藥理學(xué)研究，同時通過比較藥物相關(guān)的藥效標(biāo)志物絕對中性粒細胞和CD34 細胞計數(shù)情況來評估仿制藥與非格司亭相比的藥代動力學(xué)相似性。

不幸的是，目前尚未確定可有效預(yù)測RA臨床結(jié)果或提供臨床相關(guān)藥理活性

的藥效學(xué)標(biāo)志物。因此，通過藥效學(xué)信息確定生物仿制藥殘留不確定性有些困難，但若與其他適應(yīng)癥相關(guān)，則不排除使用藥效學(xué)標(biāo)記物，只是需要注意，生物仿制藥在所有適應(yīng)癥中作用機制可能不盡相同，而面臨數(shù)據(jù)不被認(rèn)可（既不被認(rèn)為具有相關(guān)性）的情況。

生物仿制藥在開發(fā)過程中應(yīng)定制更多的臨床研究，如比較臨床研究來評估藥品之間潛在的臨床差異，包括結(jié)構(gòu)和功能表征，動物試驗，人體藥代動力學(xué)和藥效學(xué)和臨床免疫原性研究等以確定仿制藥和參比藥之間殘留的不確定性。然而，臨床研究通常包含發(fā)展計劃中最昂貴和最冗長的部分，許多申請人在獲得關(guān)于待解決的剩余不確定性的全面知識之前就尋求臨床研究指導(dǎo)。 因此，F(xiàn)DA鼓勵可提高檢測差異靈敏度的臨床研究設(shè)計方案。

目前面臨的挑戰(zhàn)是如何更好地考察仿制藥和參比藥之間潛在的臨床差異。比較臨床研究的等效設(shè)計可能是合理的，但為這些研究選擇劑量，終點和評估時間通常要基于評估功效和安全性研究的公開數(shù)據(jù)。例如，歷史上，RA的生物藥物是根據(jù)6-12個月對照試驗的數(shù)據(jù)，并采用ACR20反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)合指數(shù)作為主要終點進行批準(zhǔn)的。雖然ACR20有助于區(qū)分活性治療效果與安慰劑對照組效果，但這種區(qū)分可能不夠敏感， 且通常面臨在治療平臺附近使用劑量并僅在一個時間點評估主要終點的局限性。這種方法潛在地限制了對仿制藥在任何時間是否與參比藥存在臨床差異的評估，而一個合適的等價研究設(shè)計方案在主要終點的確定方面應(yīng)基于所有相關(guān)的公開數(shù)據(jù)，具有科學(xué)性。例如，使用ACR20評估可能顯示一種仿制藥和參比藥有相同的治療效果，而另一種28關(guān)節(jié)疾病超聲評分法可能檢測到對另一種仿制藥的差異評估更為敏感，因此應(yīng)在多個時間點評估終點，考慮缺失的數(shù)據(jù)進行靈敏度分析，并評估次要終點（如復(fù)合主要終點），為生物相似性的論證提供有力的依據(jù)支持。

通常預(yù)期臨床安全性數(shù)據(jù)，包括免疫原性評估，蛋白質(zhì)之間微小差異都可能引起免疫原性和超敏反應(yīng)。生物仿制藥中制劑，雜質(zhì)，賦形劑和臨床無活性組分可能與參比藥不同，而導(dǎo)致臨床上免疫原性差異，成為生物仿制藥許可的障礙，在考慮需要哪些數(shù)據(jù)時，應(yīng)考慮可能使用該產(chǎn)品的人群中免疫應(yīng)答及與免疫反應(yīng)相關(guān)的風(fēng)險。

以前接觸過參比藥的患者可能會增加免疫原性反應(yīng)的風(fēng)險，這種情況下，應(yīng)收集從參比藥到生物仿制藥物單次過渡的患者的安全數(shù)據(jù)，并將其與繼續(xù)服用參比藥的患者進行比較，風(fēng)濕病適應(yīng)癥生物仿制藥發(fā)展方案中最好設(shè)計這種研究。 作為一個科學(xué)問題，F(xiàn)DA期望申請人通過仿制藥和參比藥之間免疫原性和藥代動力學(xué)特性的比較，來論證仿制藥的安全性和有效性。

在參比藥獲得許可的多種條件下，生物仿制藥的許可可能是僅在一種使用條件下的數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進行的。開發(fā)計劃中未直接研究的使用條件下的生物相似性證明可由申請人提供由其中一個條件外推到其他使用條件的相關(guān)科學(xué)依據(jù)，確保仿制藥和參比藥之間“高度相似”。正如FDA指南中詳述,科學(xué)依據(jù)應(yīng)注明每個使用條件中以下幾個因素及患者人數(shù)：作用機制，藥代動力學(xué)和生物分布；免疫原性；不同預(yù)期毒性；以及任何其他可能影響安全性和有效性的因素。FDA已確定使用條件的不同并不影響生物仿制藥的外推許可，只是在某些情況下，需要額外的臨床研究來解決特定使用條件下殘留的不確定性。

除了生物相似性，BPCI法案還規(guī)定了替換標(biāo)準(zhǔn)，申請人必須提交仿制藥和參比藥滿足生物相似性的信息，在任何給定的病人身上都能夠產(chǎn)生和參比藥一致的臨床試驗結(jié)果，而且對多次使用該產(chǎn)品的患者，要確保在交替使用參比藥和仿制藥時安全性和降低療效方面的風(fēng)險不能比不交替使用時大?？商鎿Q產(chǎn)品可以替代參比藥而不經(jīng)處方醫(yī)療保健提供者的干預(yù)，因此除了生物相似之外，還應(yīng)考慮藥物的可替代性。FDA目前也正在評估需要哪些額外的數(shù)據(jù)才能滿足互換性標(biāo)準(zhǔn)。

生物產(chǎn)品大而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)對生物相似性的論證提出了挑戰(zhàn)。生物仿制藥的開發(fā)旨在證明仿制藥與參比藥之間的相似性，相反，新的生物產(chǎn)品的開發(fā)則需要證明產(chǎn)品的安全性和有效性。論證生物相似性的基礎(chǔ)是生物仿制藥和參比藥之間大量全面的結(jié)構(gòu)和功能信息比較數(shù)據(jù)及相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)，以此來解決殘留不確定性的問題，確保仿制藥和參比藥之間高度相似，在臨床應(yīng)用的安全性、純度和效價方面不存在顯著差異。采用階梯式方法為手頭的科學(xué)問題制定發(fā)展方案論證生物相似性可簡化許可路徑。

參考文獻：

Nikolov NP, Shapiro MA.An FDA perspective on the assessment of proposed biosimilar therapeutic proteins inrheumatology. Nat Rev Rheumatol. 2017 Feb;13(2):123-128.