血漿（1，3）-β -D-葡聚糖檢測(cè)對(duì)血液病患者侵襲性真菌病的診斷價(jià)值

蕭晨路，韓立中，倪語(yǔ)星
（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床微生物科，上海 200025）

摘要：目的 評(píng)價(jià)（1，3）-β-D-葡聚糖（BDG）檢測(cè)（簡(jiǎn)稱(chēng)G試驗(yàn)）對(duì)惡性血液病患者侵襲性真菌?。↖FD）的診斷價(jià)值。 方法 回顧性分析399例血液系統(tǒng)腫瘤患者每周2～3次的血漿G試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則（修訂版）》中的標(biāo)準(zhǔn)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，利用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析G試驗(yàn)對(duì)IFD的診斷價(jià)值。 結(jié)果 G試驗(yàn)診斷IFD的敏感性為78.5%，特異性為79.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.0%，陰性預(yù)測(cè)值為82.7%。結(jié)論 血漿BDG水平與IFD感染有直接聯(lián)系，每周檢測(cè)2～3次，結(jié)合影像學(xué)判斷方法能幫助診斷和排除IFD，提高IFD臨床診治效果。

關(guān)鍵詞：（1，3）- β-D-葡聚糖；侵襲性真菌??；血液系統(tǒng)腫瘤

近年來(lái)由于造血干細(xì)胞移植、實(shí)體器官移植的廣泛開(kāi)展，高強(qiáng)度免疫抑制劑和大劑量化療藥物的應(yīng)用以及各種導(dǎo)管的體內(nèi)介入、留置等，臨床上侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD）的患病率明顯上升［1-2］，成為骨髓及器官移植受者、接受化療的惡性血液病和惡性腫瘤患者、獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者以及其他危重病患者的嚴(yán)重并發(fā)癥及重要死亡原因［2］。目前，血漿真菌細(xì)胞壁成分——（1，3）-β-D-葡聚糖［（1，3）-beta-D-glucosan，BDG］檢測(cè)（簡(jiǎn)稱(chēng)G試驗(yàn)）、曲霉菌半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)（簡(jiǎn)稱(chēng)GM試驗(yàn)）及血液和支氣管肺泡灌洗液中的各種真菌聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是診斷IFD的微生物學(xué)檢測(cè)方法，其敏感性和特異性均達(dá)到80%以上［3-5］。本研究對(duì)G試驗(yàn)診斷IFD的臨床可靠性和預(yù)測(cè)IFD的療效進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，旨在探討B(tài)DG在血液病患者IFD中的臨床價(jià)值。

材料和方法

一、研究對(duì)象

收集2013年1至12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院血液科（包括骨髓移植病區(qū)和血液臨床中心）患者399例，其中男230例、女169例，中位年齡（年齡范圍）為41.19（17～77）歲。其中急性非淋巴細(xì)胞白血病203例、急性淋巴細(xì)胞白血病86例、骨髓增生異常綜合征16例、非霍奇金淋巴瘤43例、霍奇金淋巴瘤21例、多發(fā)性骨髓瘤15例、再生障礙性貧血13例、其他病例2例。

二、儀器與試劑

MB-80微生物動(dòng)態(tài)快速檢測(cè)系統(tǒng)、T01智能恒溫儀、冰浴槽以及GKT25M Set動(dòng)態(tài)真菌檢測(cè)試劑盒均由北京金山川科技發(fā)展公司生產(chǎn)。

三、方法

1.　分組 IFD診斷依據(jù)《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則（修訂版）》［6］中的標(biāo)準(zhǔn)并做適當(dāng)調(diào)整。具體診斷標(biāo)準(zhǔn)為：（1）IFD確診病例：絕大多數(shù)情況需在病變組織中檢出真菌成分；（2）IFD臨床診斷病例：至少符合1項(xiàng)宿主因素，1項(xiàng)微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)或可能感染部位符合1項(xiàng)臨床標(biāo)準(zhǔn)；（3）IFD疑似病例：至少符合診療原則所列的1項(xiàng)宿主因素，可能感染部位符合1項(xiàng)臨床標(biāo)準(zhǔn)，但無(wú)微生物學(xué)證據(jù)。按上述標(biāo)準(zhǔn)，本研究中的研究對(duì)象被分為確診IFD組（2例）、臨床診斷IFD組（128例）、可疑IFD組（101例）和非IFD組（168例）。

2.　抗真菌治療 對(duì)于出現(xiàn)粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱的患者進(jìn)行病原菌（細(xì)菌和真菌）培養(yǎng)（痰、血等），并給予一線廣譜抗菌藥物——碳青霉烯類(lèi)藥物（亞胺培南或美羅培南）及口服氟康唑進(jìn)行治療，并依據(jù)細(xì)菌學(xué)和藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果作相應(yīng)調(diào)整。廣譜抗菌藥物治療5 d無(wú)效者行胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描（computerized tomography，CT），CT顯示肺部浸潤(rùn)性病灶和/或G試驗(yàn)呈現(xiàn)陽(yáng)性的患者停用氟康唑，改用廣譜抗真菌藥物如伊曲康唑或伏立康唑、醋酸卡泊芬凈治療可能的曲霉感染。

3.　影像學(xué)檢查 在記錄G試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)對(duì)部分患者進(jìn)行影像學(xué)檢查（CT或高分辨率CT），并記錄結(jié)果。

4.　血漿BDG的檢測(cè) 所有操作步驟均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用無(wú)熱原抗凝采血管采取靜脈血2 mL，以1 000×g離心1 min分離血漿。取上清0.1 mL，加至0.9 mL的樣本處理液D中，混勻后置70 ℃恒溫10 min，取出后立刻放入冰水浴中，為待測(cè)血漿樣本。待測(cè)樣本0.2 mL直接加至酶反應(yīng)主劑A中，溶解后移液至標(biāo)準(zhǔn)玻璃反應(yīng)管，插入MB-80微生物動(dòng)態(tài)快速檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后儀器自動(dòng)計(jì)算待測(cè)血漿中BDG的含量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

按照廠家推薦的60 pg/mL為診斷界值，將BDG＞60 pg/mL定為陽(yáng)性，應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算G試驗(yàn)的陽(yáng)性率、陰性率、敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。臨床診斷IFD組中死亡與好轉(zhuǎn)患者的數(shù)據(jù)采用2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、G試驗(yàn)對(duì)血液病患者IFD的診斷價(jià)值

臨床診斷IFD組G試驗(yàn)陽(yáng)性率為78.1%，可疑IFD組G試驗(yàn)陽(yáng)性率為18.8%，非IFD組有134例患者G試驗(yàn)陰性，陰性率為79.8%。將確診IFD以及臨床診斷IFD作為真陽(yáng)性，非IFD作為真陰性，計(jì)算出G試驗(yàn)的敏感性為78.5%，特異性為79.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.0%，陰性預(yù)測(cè)值為82.7%。見(jiàn)表1。

表1　血漿G試驗(yàn)對(duì)血液病患者IFD的診斷價(jià)值［例（%）］

組別例數(shù)　BDG陽(yáng)性　陰性確診IFD組　2　2（100.0）　0（0.0）臨床診斷IFD組　128　100（78.1）　28（21.9）可疑IFD組　101　19（18.8）　82（81.2）非IFD組　168　34（20.2）　134（79.8）合計(jì)　399　155（38.9）　244（61.2）

二、BDG在患者病程中的動(dòng)態(tài)變化

本研究128例臨床診斷IFD患者中死于肺部IFD感染者22例，好轉(zhuǎn)者106例。其中有49例接受了抗真菌治療。以臨床診斷IFD病例開(kāi)始使用抗真菌藥物為診斷時(shí)間點(diǎn)，首次G試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)在臨床診斷前15 d至臨床診斷后3 d，平均出現(xiàn)于臨床診斷前3.5 d。在49例接受了抗真菌治療的臨床診斷IFD患者中，77.6%（38/49）的患者出現(xiàn)了肺部IFD的特征性影像學(xué)改變，僅有3例為典型的月暈征，21例為實(shí)變影，5例為新月征，4例為毛玻璃樣改變， 2例為結(jié)節(jié)影，3例為混合影像學(xué)改變，11例未出現(xiàn)明確影像學(xué)改變。38例出現(xiàn)影像學(xué)改變的患者，有28例出現(xiàn)了BDG水平的升高。

連續(xù)監(jiān)測(cè)臨床診斷I F D患者血漿G試驗(yàn)結(jié)果，好轉(zhuǎn)組、死亡組BDG水平分別為（100.63±47.51）、（364.97±96.24）pg/mL，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1　死亡組與好轉(zhuǎn)組患者BDG水平隨治療時(shí)間的變化

討 論

IFD是惡性血液病患者的常見(jiàn)并發(fā)癥。由于缺乏典型的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查陽(yáng)性率低、影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，常導(dǎo)致IFD診斷困難，易發(fā)生漏診或誤診。目前，歐美國(guó)家及我國(guó)IFD的診斷標(biāo)準(zhǔn)只有2條：組織病理學(xué)證據(jù)和活組織樣本或正常情況下無(wú)菌腔液和/或組織樣本真菌培養(yǎng)陽(yáng)性［7］。而血液病患者病情較為嚴(yán)重且常合并其他感染性疾病，累及器官組織不明確，侵入性檢查較難實(shí)施，致使IFD診斷較困難。近年來(lái)，非侵襲性實(shí)驗(yàn)室技術(shù)尤其是真菌抗原檢測(cè)受到廣泛關(guān)注，主要包括GM試驗(yàn)和G試驗(yàn)，已成為真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一 。BDG廣泛存在于除接合菌、隱球菌之外的真菌細(xì)胞壁中，占真菌細(xì)胞壁成分的50%以上，當(dāng)發(fā)生IFD時(shí)，BDG可以從真菌胞壁釋放，進(jìn)入血液或其他體液中，而淺表真菌感染（如口咽部念珠菌病等）或真菌定植時(shí)BDG極少釋放入血液。因此檢測(cè)血漿BDG水平對(duì)診斷IFD具有較高的特異性［5-8］。

G試驗(yàn)作為診斷IFD的方法被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，然而不足之處就是在檢測(cè)中可能出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。造成G試驗(yàn)假陽(yáng)性的具體原因包括：（1）中空纖維超濾膜洗滌液、腎透析儀（人工腎、血液透析儀）洗滌液殘留；（2）紗布、棉球等實(shí)驗(yàn)室污染；（3）抗腫瘤藥物中蘑菇葡聚糖、K多聚糖等成分含有BDG類(lèi)似物；（4）化療或放療引起的黏膜炎癥，使得食物中BDG可以通過(guò)受損的胃腸道黏膜進(jìn)入血液；（5）以真菌為原料制成的抗菌藥物；（6）感染某些細(xì)菌［8-11］。本研究中有24例患者在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)時(shí)出現(xiàn)G試驗(yàn)值極端升高（＞1 000 pg/mL）的現(xiàn)象，調(diào)查后發(fā)現(xiàn)是使用了香菇多糖等藥物產(chǎn)生交叉抗原的緣故。綜上所述，當(dāng)G試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)異常升高時(shí)需要排除其他藥物產(chǎn)生的假陽(yáng)性。本研究收集的臨床診斷IFD患者中，有28例BDG監(jiān)測(cè)結(jié)果為陰性，被認(rèn)為是假陰性結(jié)果，這可能與真菌種類(lèi)有關(guān)，如此組中有8例患者在黏膜等部位培養(yǎng)出真菌。據(jù)研究報(bào)道，淺部真菌感染時(shí)，BDG未被釋放出來(lái)，體液中BDG水平不增加，導(dǎo)致G試驗(yàn)呈假陰性［7］。

本研究收集的399例患者根據(jù)《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則（修訂版）》進(jìn)行分組。以確診IFD以及臨床診斷IFD作為真陽(yáng)性，非IFD作為真陰性，計(jì)算出G試驗(yàn)的敏感性為78.5%，特異性為79.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.0%，陰性預(yù)測(cè)值為82.7%?？梢钥闯鯣試驗(yàn)對(duì)IFD有較高的陰性預(yù)測(cè)價(jià)值，能幫助診斷和排除IFD，提高IFD的臨床診治效果。

本研究結(jié)果顯示，患者血漿BDG水平與其病情進(jìn)展也有一定的聯(lián)系。臨床診斷IFD組中好轉(zhuǎn)患者連續(xù)檢測(cè)血漿BDG，血漿BDG水平在治療后1～2周內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而死亡組患者的血漿BDG水平則維持在較高水平并有明顯升高趨勢(shì)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而且部分抗真菌治療有效的患者在3周之內(nèi)血漿BDG仍然＞60 pg/mL，提示抗真菌治療需要很長(zhǎng)的時(shí)間，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于抗真菌治療的療程還未達(dá)成共識(shí)。當(dāng)患者接受抗真菌治療后血漿BDG水平仍持續(xù)升高，則提示需要更換抗真菌藥物或聯(lián)合應(yīng)用2種抗真菌藥物。因此，對(duì)于IFD高危患者進(jìn)行連續(xù)血漿BDG水平監(jiān)測(cè)，將有助于患者病情監(jiān)測(cè)及藥物的調(diào)整，同時(shí)血漿BDG持續(xù)升高也預(yù)示患者預(yù)后較差。

肺部高分辨CT檢查可以幫助診斷IFD，比較公認(rèn)的特征性影像為月暈征。33%～60%的IFD患者可出現(xiàn)月暈征，這一特征性影像改變僅在真菌感染發(fā)生的最初5 d內(nèi)出現(xiàn)，其中大約75%的患者月暈征會(huì)在1周內(nèi)消失，因此IFD的這一影像學(xué)特性限制了高分辨CT在IFD早期診斷中的應(yīng)用［12-14］。本研究臨床診斷IFD患者中77.6% （38/49）出現(xiàn)了肺部IFD的特征性影響學(xué)改變，僅有3例為典型的月暈征，11例表現(xiàn)為實(shí)變影，5例為新月征，4例為毛玻璃樣改變， 2例為結(jié)節(jié)影，3例為混合影像學(xué)改變，11例未出現(xiàn)明確影像學(xué)改變。G試驗(yàn)一般早于影像學(xué)3～11 d出現(xiàn)結(jié)果。將G試驗(yàn)與影像學(xué)指標(biāo)共同考慮能更好地診斷IFD。為了更好地治療IFD，應(yīng)該將G試驗(yàn)和影像學(xué)的結(jié)果相結(jié)合指導(dǎo)抗真菌藥物的經(jīng)驗(yàn)性治療和/或搶先治療，這有利于減少?gòu)V譜抗真菌藥物的使用，預(yù)防耐藥菌株的增加。

總之，血漿G試驗(yàn)對(duì)IFD有著較高的診斷價(jià)值，將G試驗(yàn)與高分辨率CT檢查綜合分析可以在疾病早期進(jìn)行診斷，為臨床醫(yī)生盡早干預(yù)治療節(jié)約時(shí)間，降低患者死亡率，幫助臨床合理用藥，防止抗真菌藥物的過(guò)度使用。

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The detection of （1，3）-beta-D-glucosan in hematological patients with invasive fungal disease

XIAO Chenlu，HAN Lizhong，NI Yuxing.
（Department of Microbiology，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025，China）

Abstract：Objective To evaluate the detection of （1，3）-beta-D-glucosan（BDG）（G test） in hematological patients with invasive fungal disease （IFD）. Methods A retrospective study was performed for 399 hematological malignancy patients，plasma G tests were performed for 2-3 times a week. The Principle and Diagnostic Criteria of the Disease of Hematopoietic System/Tumor in Patients with Invasive Fungal Infection（Revised Edition） was used as criteria. The diagnostic significance was evaluated by SPSS 11.5 software. Results The sensitivity of G test was 78.5% for the diagnosis of IFD，the specificity was 79.8%，the positive predictive value was 75.0%， and the negative predictive value was 82.7%. Conclusions Plasma BDG is correlated with IFD. Plasma G test should be taken 2-3 times per week. Combined with medical imaging，G test could improve the diagnosis of IFD and treatment efficiency and reduce the medical burden of patients.

Key words：（1，3）-beta-D-glucosan；Invasive fungal disease；Hematological malignancy

（收稿日期：2015-08-16）

（本文編輯：姜 敏）

基金項(xiàng)目：衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201002021）

作者簡(jiǎn)介：蕭晨路，女，1984年生，碩士，技師，主要從事侵襲性真菌病快速診斷的實(shí)驗(yàn)研究。

通訊作者：倪語(yǔ)星，聯(lián)系電話：021-64370045-600633。