同型半胱氨酸質(zhì)控品的制備和性能評(píng)價(jià)

石建新1，朱 巖2，蔣 英1，向瑩君1，林惠玲1，段桂開2

（1. 深圳市福田區(qū)慢性病防治院，廣東 深圳 518048； 2. 深圳市婦幼保健院，廣東 深圳 518028）

摘要：目的研制一種液體非定值同型半胱氨酸（Hcy）室內(nèi)質(zhì)控品，并初步評(píng)價(jià)其性能。方法采用混合人血清為基質(zhì)制備Hcy質(zhì)控品，依據(jù)CNAS-GL03的要求對(duì)其均勻性、穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。將自制質(zhì)控品應(yīng)用于室內(nèi)質(zhì)量控制，并與朗道質(zhì)控品進(jìn)行比較。結(jié)果自制質(zhì)控品均勻性和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果均符合要求，與朗道質(zhì)控品比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論自制質(zhì)控品具備較好的均勻性和穩(wěn)定性，可用于臨床實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸；質(zhì)控品；均勻性；穩(wěn)定性

根據(jù)我國《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)對(duì)開展的檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，目的在于監(jiān)測(cè)檢測(cè)過程，以評(píng)價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果是否可靠，決定常規(guī)檢驗(yàn)報(bào)告能否發(fā)出，是保證高質(zhì)量操作的必要措施[1]。在室內(nèi)質(zhì)量控制活動(dòng)中，質(zhì)控品是關(guān)鍵因素。由于進(jìn)口同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）質(zhì)控品價(jià)格非常昂貴，目前臨床實(shí)驗(yàn)室很少使用，而國產(chǎn)質(zhì)控品質(zhì)量又參差不齊，為節(jié)約檢驗(yàn)成本，提高檢驗(yàn)質(zhì)量，臨床實(shí)驗(yàn)室自制質(zhì)控品就顯得非常必要。以往也有學(xué)者對(duì)自制質(zhì)控品進(jìn)行了相關(guān)研究[2]，但在Hcy自制質(zhì)控品方面目前國內(nèi)尚未見報(bào)道。因此，實(shí)驗(yàn)室自行研制一種性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉的Hcy質(zhì)控品有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

檢測(cè)儀器為Mindray BS-800全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞公司），質(zhì)控品采用英國朗道公司產(chǎn)品（批號(hào)為327004）。 Hcy檢測(cè)試劑和校準(zhǔn)品由永和陽光生物科技有限公司提供（試劑批號(hào)為150401，校準(zhǔn)品批號(hào)為14-1112）。乙二醇（分析純）由天津永大化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 質(zhì)控品的制備

除乳糜血、溶血、黃疸標(biāo)本外，每天收集實(shí)驗(yàn)室剩余標(biāo)本的血清，經(jīng)乙型肝炎表面抗體、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒和梅毒檢測(cè)陰性后，置-20 ℃冷凍保存。當(dāng)血清收集到足夠量時(shí)，混勻，離心，過濾，去除血清中沉淀物。置-20 ℃冰箱儲(chǔ)存24 h，再于4 ℃靜置解凍，不能搖動(dòng)，待血清完全解凍后輕輕吸取上1/2血清至其他容器中，作為低水平質(zhì)控品的原液；剩下的1/2血清作為高水平質(zhì)控品的原液。分別取樣測(cè)定其Hcy濃度是否達(dá)到預(yù)期水平，如未達(dá)預(yù)期值范圍，可將此2種原液再置-20 ℃儲(chǔ)存24 h，重復(fù)之前的步驟，直至達(dá)到預(yù)期范圍。分別加入適量的乙二醇，并將此含有乙二醇的高、低2個(gè)水平的質(zhì)控品原液通過相互配比來進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)，最終制成目標(biāo)濃度范圍的質(zhì)控品。將制成的質(zhì)控品用0.2 μm孔徑的無菌過濾器過濾除菌，以500 μL為單位準(zhǔn)量分裝到無菌西林瓶中，封口保存置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 性能評(píng)價(jià)方法

所有測(cè)試均在儀器維護(hù)保養(yǎng)后，檢測(cè)項(xiàng)目重新標(biāo)定，并在原配質(zhì)控品在控情況下測(cè)定。

1.3.1 均勻性檢測(cè)[3]參照CNAS-GL03中均勻性檢驗(yàn)“4.2 單因子方差分析”方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。質(zhì)控品制備后即隨機(jī)取自制質(zhì)控品10瓶，第1次按1→10的順序檢測(cè)，第2次按10→1的順序重復(fù)測(cè)定，根據(jù)所得結(jié)果計(jì)算出F值。若計(jì)算的F值＜F臨界值（a=0.05），則表明樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。

1.3.2 穩(wěn)定性檢測(cè)[3]參照CNAS-GL03中穩(wěn)定性檢驗(yàn)“5.2.2 兩個(gè)平均值之間的一致性”t檢驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。質(zhì)控品制備后隨機(jī)取自制質(zhì)控品6瓶，每瓶重復(fù)檢測(cè)項(xiàng)目2次，將得到的均值作為初始均值，再分別于第2、4、6、8、10、12個(gè)月隨機(jī)抽取6瓶-20℃保存的自制質(zhì)控品，按以上相同方法進(jìn)行檢測(cè)，分別取其平均值與初始均值比較，若計(jì)算出的t＜t0.05（10），表明樣品之間無明顯差異，樣品是穩(wěn)定的。

1.3.3 和朗道質(zhì)控品比較 每日隨機(jī)取2種濃度水平的自制質(zhì)控品各1份，與朗道質(zhì)控品一同上機(jī)檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)3個(gè)月，觀察實(shí)際使用情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，用配對(duì)t檢驗(yàn)比較自制質(zhì)控品和朗道商品質(zhì)控品間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 均勻性檢測(cè)

2個(gè)水平的Hcy質(zhì)控品均勻性檢測(cè)結(jié)果均符合要求。見表1。

表1 2個(gè)不同水平Hcy質(zhì)控品均勻性檢測(cè)（μmol/L）

樣本號(hào) 低水平 高水平第1次檢測(cè) 第2次檢測(cè) 第1次檢測(cè) 第2次檢測(cè)1 14.91 14.78 22.12 21.91 2 14.58 14.85 21.56 21.92 3 14.82 14.51 21.85 21.39 4 14.77 14.89 22.15 21.65 5 14.79 15.04 21.65 21.44 6 14.88 14.69 21.88 21.42 7 14.92 14.68 21.31 21.63 8 14.62 14.72 21.45 21.89 9 14.89 14.55 21.79 21.43 10 14.77 14.51 21.32 21.78總平均值 14.76 21.68F值 0.59 0.74P值 ＞0.05 ＞0.05

2.2 穩(wěn)定性檢測(cè)

自制質(zhì)控品保存第2、4、6、8、10、12個(gè)月檢測(cè)結(jié)果的均值分別與即刻檢測(cè)的均值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），自制Hcy質(zhì)控品的穩(wěn)定性符合要求。見表2。

2.3 自制質(zhì)控品與朗道質(zhì)控品的對(duì)比

以朗道質(zhì)控品作為參照，自制質(zhì)控品的s和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）與朗道質(zhì)控品的實(shí)測(cè)值相近，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 2種不同濃度Hcy質(zhì)控品穩(wěn)定性分析（μmol/L，

保存時(shí)間 低水平 高水平即刻 14.69±0.24 21.62±0.42第2月 14.67±0.30 21.58±0.45第4月 14.71±0.19 21.46±0.43第6月 14.70±0.28 21.59±0.47第8月 14.72±0.28 21.41±0.46第10月 14.59±0.32 21.39±0.38第12月 14.58±0.32 21.41±0.49

表3 自制質(zhì)控品與朗道質(zhì)控品實(shí)測(cè)值的對(duì)比

質(zhì)控品來源 低水平高水平x（μmol/L） s（μmol/L） CV（%） x（μmol/L） s（μmol/L） CV（%）自制 14.67 0.37 2.52 21.46 0.52 2.42朗道 14.71 0.39 2.65 21.51 0.58 2.70t值 0.82 0.94P值 ＞0.05 ＞0.05

3 討論

Hcy是甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物，也稱高半胱氨酸。臨床研究表明高水平Hcy是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死的危險(xiǎn)因素，其水平高低與疾病的危險(xiǎn)程度成正比[4]。臨床上還將伴有高Hcy血癥的原發(fā)性高血壓定義為H型高血壓[5]。鑒于Hcy臨床意義的重要性，如何確保其檢測(cè)質(zhì)量也就顯得尤其重要。在檢測(cè)質(zhì)量方面，室內(nèi)質(zhì)量控制是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，而質(zhì)控品是保證質(zhì)控工作的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。質(zhì)控品根據(jù)有無測(cè)定值分為定值質(zhì)控品和非定值質(zhì)控品，根據(jù)物理性狀分為凍干質(zhì)控品、液態(tài)質(zhì)控品和混合血清等，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)各自的情況選用任何一種質(zhì)控品作為室內(nèi)質(zhì)控品[6]。Hcy項(xiàng)目現(xiàn)普遍使用的是商品化定值液態(tài)質(zhì)控品，雖使用方便，但由于進(jìn)口Hcy質(zhì)控品價(jià)格昂貴，臨床上目前很少使用，而國產(chǎn)質(zhì)控品在不同儀器、方法上質(zhì)量有較大差異，且多為水劑制成，這與Hcy在血清中的存在狀態(tài)有較大區(qū)別，難免會(huì)因基質(zhì)效應(yīng)而影響到實(shí)際質(zhì)控效果。根據(jù)張路等[7]統(tǒng)計(jì)的參加全國Hcy室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的292家實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制數(shù)據(jù)顯示，依據(jù)1/3允許總誤差（allowable total error，TEa），通過率僅為 63.36%～76.42%，按照1/4 TEa，通過率僅為34.25%～57.55%，實(shí)驗(yàn)室Hcy檢測(cè)的CV并不能令人滿意；另外，在292家實(shí)驗(yàn)室中有近2/3的實(shí)驗(yàn)室只使用1個(gè)水平的質(zhì)控品。由此可見，目前實(shí)驗(yàn)室Hcy檢測(cè)的實(shí)際質(zhì)控效果并不理想，這與商品化Hcy質(zhì)控品的質(zhì)量優(yōu)劣不一和價(jià)格偏高有一定的關(guān)系。因此，實(shí)驗(yàn)室自制Hcy質(zhì)控品就顯得非常必要。我國《臨床實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)量控制指南》（GB/T 20468-2006）也明確指出，實(shí)驗(yàn)室可以自制質(zhì)控品，質(zhì)控品的成分應(yīng)與檢測(cè)患者樣本的基質(zhì)相似或一致，質(zhì)控品應(yīng)該均一和穩(wěn)定。

本研究采用混合人血清為基質(zhì)，自制了液體非定值Hcy質(zhì)控品。較理想的臨床化學(xué)質(zhì)控品至少應(yīng)具備以下特性：（1）人血清基質(zhì)；（2）無傳染性；（3）添加劑和調(diào)制物的數(shù)量盡可能少；（4）瓶間變異??；（5）質(zhì)控品的穩(wěn)定時(shí)間足夠長[8]。其中分析物的穩(wěn)定性和均勻性是評(píng)價(jià)質(zhì)控品的主要指標(biāo)。在穩(wěn)定性和均勻性的評(píng)價(jià)上，以往許多學(xué)者采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正法規(guī)中能力比對(duì)檢驗(yàn)的分析物可接受范圍作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[9-10]，但該標(biāo)準(zhǔn)目前對(duì)Hcy項(xiàng)目的可接受范圍尚未作出具體規(guī)定，因此本研究參考CNAS-GL03進(jìn)行評(píng)價(jià)。表1顯示，自制Hcy質(zhì)控品的均勻性良好，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），查得F0.05（9，10）=3.02，自制水平1和水平2質(zhì)控品計(jì)算的F值分別為0.59和0.74，均＜F臨界值，表明在顯著性水平為0.05時(shí)，樣品內(nèi)和樣品間無明顯差異，樣品是均勻的。說明自制質(zhì)控品瓶內(nèi)重復(fù)性良好，瓶間變異小，符合質(zhì)控品均勻性要求[3，8]。由表2可以看出，自制質(zhì)控品的穩(wěn)定期大于12個(gè)月，將2、4、6、8、10、12個(gè)月檢測(cè)的均值分別與即刻檢測(cè)的均值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），查t界值表t0.05（10）=1.812，計(jì)算的t值均＜t0.05（10），這說明自制質(zhì)控品穩(wěn)定性良好，在1年以內(nèi)無明顯變化，符合質(zhì)控品穩(wěn)定性要求[3，8]。本研究同時(shí)將自制質(zhì)控品和朗道質(zhì)控品進(jìn)行比較。表3結(jié)果顯示，自制質(zhì)控品的濃度接近朗道質(zhì)控品的濃度，其s和CV接近朗道質(zhì)控品實(shí)際測(cè)量值的s和CV，二者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明自制質(zhì)控品的實(shí)際性能良好。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)在以往質(zhì)控品的制備過程中，由于日常檢測(cè)標(biāo)本中高濃度的原血清很少，收集、制備高水平質(zhì)控品往往比較困難，所以以往許多學(xué)者[10-11]采用人為添加目標(biāo)化學(xué)成分或加入其他高值質(zhì)控品的方式來調(diào)高自制質(zhì)控品濃度，但這無疑會(huì)增加添加劑的種類，加大基質(zhì)效應(yīng)和制備成本，并且有些添加劑也難以獲取，一般實(shí)驗(yàn)室操作起來比較困難。本研究利用正常人血清在自然冷凍過程中其物質(zhì)濃度會(huì)產(chǎn)生由下至上的梯度現(xiàn)象，制備了高、低2個(gè)水平質(zhì)控品原料的方法，再通過適當(dāng)配比，能夠很好地解決這一問題，從而調(diào)節(jié)質(zhì)控品濃度至所需水平。究其原因可能是由于冷凍溫度對(duì)溶質(zhì)遷移的影響[12]，冷凍溫度越高，即越接近冰點(diǎn)溫度時(shí)，血清中固液界面向前推移的速度就越慢，這就給了溶質(zhì)足夠的時(shí)間進(jìn)行擴(kuò)散遷移，最終把大量的溶質(zhì)聚集在很小的體積內(nèi)，致使?jié)舛燃眲≡龃蟆Ｍ瑫r(shí)，實(shí)驗(yàn)裝置的徑高比對(duì)溶質(zhì)的遷移也有一定影響[12]，實(shí)驗(yàn)裝置的徑高比越大，溶質(zhì)遷移的路程越長，凝固時(shí)間延長，溶質(zhì)得以更好地遷移。因此，在質(zhì)控品的制備過程特別是高值質(zhì)控原血清的獲取上，建議通過將正常物質(zhì)濃度的血清標(biāo)本經(jīng)冷凍處理和加大實(shí)驗(yàn)裝置的徑高比來提高血清中物質(zhì)的濃度，從而達(dá)到獲得高值質(zhì)控原血清的目的。但對(duì)于不同物質(zhì)，要獲取的濃度不同，其所需的冷凍溫度、徑高比、冷凍時(shí)間等可能都會(huì)有所不同，這些都需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，采用本研究中的方法自制Hcy質(zhì)控品能夠滿足日常室內(nèi)質(zhì)量控制要求，再結(jié)合室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的結(jié)果，能夠保證臨床檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、穩(wěn)定，且有原料來源方便、價(jià)格便宜之優(yōu)勢(shì)，適合在各級(jí)醫(yī)院，特別是基層醫(yī)院推廣使用。由于時(shí)間、實(shí)驗(yàn)條件等的限制，對(duì)于自制質(zhì)控品在不同儀器、不同試劑、不同檢測(cè)方法等方面的特性還有待進(jìn)一步研究和完善。

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Preparation and performance evaluation of quality control material for homocysteine

SHI Jianxin1，ZHU Yan2，JIANG Ying1，XIANG Yingjun1，LIN Huiling1，DUAN Guikai2.
（1. Futian Center for Chronic Disease Control，Shenzhen518048，Guangdong，China；2. Shenzhen Maternity and Child Healthcare Hospital，Shenzhen518028，Guangdong，China）

Abstract：ObjectiveTo prepare a liquid internal quality control material for homocysteine （Hcy） without assigned value，and to investigate its performance.MethodsPooled human serum was used as the medium of the quality control material for Hcy．The homogeneity and stability of quality control material were evaluated according to CNAS-GL03. The self-made quality control material was also used in internal quality control and was compared with RANDOX quality control material.ResultsThe homogeneity and stability of the self-made quality control material met related requirements．Compared with RANDOX quality control material，there was no statistical signifi cance （P＞0.05）.ConclusionsThe self-made quality control material for Hcy has good homogeneity and stability，and it can be used for the internal quality control in clinical laboratories.

Key words：Homocysteine；Quality control material；Homogeneity；Stability

文章編號(hào)：1673-8640（2017）04-0343-04

中圖分類號(hào)：：R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.04.022

（收稿日期：2016-03-18）

（本文編輯：李 欣）

基金項(xiàng)目：深圳市科技研發(fā)資金項(xiàng)目（JCYJ20150402144008782）

作者簡介：石建新，男，1982年生，碩士，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)研究。

通信作者：蔡應(yīng)木，聯(lián)系電話：0754-88905261。