有人會(huì)想知道，韓春雨老師是怎么樣發(fā)明NgAgo的？這是一個(gè)好問(wèn)題，理解了這個(gè)，說(shuō)不定你也會(huì)發(fā)明自己的基因編輯的技術(shù)。先不論爭(zhēng)議，NgAgo理論上我覺(jué)得應(yīng)該是可行的。

我們先來(lái)解釋一下，人類是如何來(lái)解決問(wèn)題的。人類解決問(wèn)題的方法，其實(shí)很簡(jiǎn)單，說(shuō)簡(jiǎn)單點(diǎn)，就是搜索答案。是不是覺(jué)得這就是一句廢話？其實(shí)不是，這個(gè)最早是1958年，心理學(xué)家A. Newell等人提出的“通用問(wèn)題解決程序”里提到的，人類會(huì)通過(guò)已知的答案來(lái)解決未知的問(wèn)題。

舉個(gè)簡(jiǎn)單的例子，比如說(shuō)，你肚子餓了，于是提出一個(gè)簡(jiǎn)單的問(wèn)題：肚子餓了怎么辦。然后從已知的答案中尋找，發(fā)現(xiàn)吃飯可以解決肚子餓的問(wèn)題，于是整個(gè)問(wèn)題得到了解決。

那我們來(lái)看看NgAgo是怎么發(fā)明的。

首先，在基因時(shí)代的大背景下，需要解決的問(wèn)題出現(xiàn)了，我們需要做有效的基因敲除。那如何來(lái)做基因敲除呢？

最早大家想到的方法叫T-DNA插入突變和轉(zhuǎn)座子插入突變，主要是通過(guò)類似同源重組的方法，隨機(jī)或者定向插入片段，以此做到Knock Out 或者Knock in。但這個(gè)隨機(jī)性太強(qiáng)了，說(shuō)簡(jiǎn)單點(diǎn)，就是指哪兒打哪兒……

既然知道有同源重組，那利用同源重組的方法是不是能做到定時(shí)定向來(lái)編輯基因呢？問(wèn)題就變成了，如何利用同源重組的方法了。

于是誕生了Cre/LoxP系統(tǒng)的基因敲減，Cre酶是噬菌體的同源重組酶。對(duì)于LoxP位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別后，可以進(jìn)行識(shí)別和敲減。但是問(wèn)題來(lái)了，LoxP位點(diǎn)怎么來(lái)呢？那就必須先要有一個(gè)在基因里具有LoxP位點(diǎn)的突變體，然后，還要做轉(zhuǎn)基因的雜交等等，反正過(guò)程很復(fù)雜。和Cre/LoxP差不多的還有酵母的FLP/FRT系統(tǒng)。

問(wèn)題來(lái)了，我們不是想要這樣的基因編輯，我們想要簡(jiǎn)單的基因編輯，那要怎么解決呢。解決這個(gè)問(wèn)題，我們需要尋找兩個(gè)答案：第一，我們要用什么來(lái)識(shí)別DNA的位點(diǎn)，第二我們要用什么來(lái)進(jìn)行“剪”。

于是第一代的編輯工具產(chǎn)生了，這個(gè)就是ZFN技術(shù)，當(dāng)然了，這個(gè)技術(shù)被壟斷了，大概是這么一回事：

首先，ZFN是鋅指蛋白，鋅指蛋白是啥？就是能結(jié)合轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位置DNA的那些蛋白啊，這些蛋白都是可以和DNA結(jié)合的，識(shí)別每一種三聯(lián)堿基的64種鋅指組合中已有大部分被發(fā)現(xiàn)并編撰成目錄，這樣的話，結(jié)合DNA以及特異性的事情已經(jīng)解決了。

那接著就是如何切開(kāi)這個(gè)DNA了，這里用到了FokI這個(gè)內(nèi)切酶，這個(gè)酶和EcoRI屬于同一個(gè)亞型，但這個(gè)酶有個(gè)特點(diǎn)，就是形成二聚體之后，才能進(jìn)行酶切。于是就產(chǎn)生了，用兩條ZFN進(jìn)行錨定，試一頭的FokI形成二聚體，進(jìn)行酶切的一個(gè)基因編輯的技術(shù)，這就是ZFN。

但ZFN的脫靶效應(yīng)特別嚴(yán)重，而且，還被壟斷了……沒(méi)錯(cuò)，壟斷了。那怎么辦呢？問(wèn)題出現(xiàn)了，要怎么樣解決對(duì)DNA識(shí)別的特異性呢？

于是開(kāi)始搜索答案了，發(fā)現(xiàn)在黃單胞菌（Xanthomonas sp.）的植物病原體中作為一種細(xì)菌感染植物的侵襲策略中，TAL效應(yīng)因子（TAL effector,TALE）被注入植物細(xì)胞中，通過(guò)靶定效應(yīng)因子特異性的基因啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。也就是說(shuō)，這是一另一種形式的可以與DNA結(jié)合的蛋白。OK，錨定的問(wèn)題解決了。那酶切呢？還是和原來(lái)一樣，繼續(xù)用FokI好了。于是，Talen技術(shù)誕生了。

TALE是以蛋白內(nèi)部的各個(gè)原件來(lái)進(jìn)行DNA結(jié)合的，每個(gè)原件只能結(jié)合三個(gè)堿基，所以導(dǎo)致的結(jié)果就是需要三個(gè)三個(gè)來(lái)拼序列，合成Talen的質(zhì)粒。怎么理解呢，就跟活字印刷差不多。拼錯(cuò)就結(jié)合不上去了，當(dāng)然，這樣的錨定DNA，也和ZFN一樣有脫靶效應(yīng)。

在繼續(xù)尋找答案的路上，1987年大阪大學(xué)的研究人員在E.coliK12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR），這是以RNA為介導(dǎo)的對(duì)DNA的序列識(shí)別。利用這個(gè)已知的答案，于是在2012年就誕生了CRISPR技術(shù)，當(dāng)然，這個(gè)技術(shù)分成幾類哈：

第一類，是需要CASCADE-crRNA復(fù)合體招募Cas3來(lái)進(jìn)行敲除的方法。

第二類，也是比較常用的，就是sgRNA:Cas9干擾復(fù)合體，其實(shí)原來(lái)應(yīng)該是transcrRNA+precrRNA經(jīng)由RNaseIII成熟獲得的Cas9：transcrRNA：crRNA復(fù)合體，但技術(shù)上簡(jiǎn)化成了sgRNA。

第三類，就Csm或者Cmr復(fù)合體或者Cas6通過(guò)crRNA的識(shí)別，切除DNA的方法。

那是不是還有別的辦法進(jìn)行敲減？當(dāng)然有，和之前一樣，只要滿足兩個(gè)答案就可以：

1）能識(shí)別DNA

2）能酶切

于是韓春雨老師找出了這樣的答案，NgAgo（Natronbacterium gregoryi Argonaute），這是一種格氏鹽堿桿菌中發(fā)現(xiàn)的DNA介導(dǎo)的雙鏈核酸內(nèi)切酶。

通過(guò)磷酸化單鏈進(jìn)行DNA位點(diǎn)的識(shí)別并進(jìn)行酶切，你要說(shuō)了，這是韓老師發(fā)明的？可以說(shuō)是他發(fā)明的，但是并不是最早發(fā)現(xiàn)的，最早Ago核酸酶是由荷蘭人John van der Oost發(fā)在Nature上的TtAgo，其可以有效地利用單鏈DNA作為短介質(zhì)，去相對(duì)精準(zhǔn)地切割基因組靶點(diǎn)，有興趣的童鞋可以自己去下載哈。

在解決問(wèn)題上，大家其實(shí)都是在不斷找合適的答案，總會(huì)有更合適的答案出現(xiàn)，只是看你是否能碰巧看見(jiàn)。

…華麗麗的分割線…

李莫愁博士：看完整個(gè)基因編輯發(fā)展的歷程，只是為了讓你能明白一件事情，一個(gè)問(wèn)題是如何來(lái)解決的。不光是在基因編輯上，所有的課題，都是在已知范圍內(nèi)尋求答案的一個(gè)過(guò)程。你回頭自己想想看是不是呢？但是其實(shí)尋求答案，也面臨著思路的迷宮，有太多答案，對(duì)的或者錯(cuò)的，要找到正確可行的，真的要著實(shí)下一番力氣呢。同時(shí)也需要不斷地追蹤文獻(xiàn)，因?yàn)榇鸢负芸赡芫驮谀骋黄獎(jiǎng)e人的文獻(xiàn)里面。好了，今天就策到這里吧。