人類腫瘤表型微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）與誤配修復(fù)（MMR）基因的失活改變有關(guān)。MSI在林奇綜合征（LS）相關(guān)的遺傳性腫瘤、散發(fā)結(jié)直腸癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌中均可見到。MSI腫瘤特征是全基因組大量微衛(wèi)星DNA重復(fù)序列的遺傳學(xué)不穩(wěn)定。MMR缺陷并不直接促發(fā)腫瘤，通過影響功能性DNA重復(fù)序列產(chǎn)生致癌作用，MMR缺陷（dMMR）腫瘤里多數(shù)原癌基因改變是體突變，是MSI的繼發(fā)改變。

研究表明某些編碼重復(fù)序列突變在腫瘤發(fā)生過程中具有陽性選擇作用，賦予腫瘤細(xì)胞生長優(yōu)勢；此外 MSI使腫瘤合成畸變、具有潛在免疫原性的新抗原，導(dǎo)致MSI腫瘤中大量細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTLs）浸潤，表達活化標(biāo)志和Tc1、Th1。CTL/Th1/細(xì)胞毒標(biāo)志增高是CRC獨立預(yù)測復(fù)發(fā)和總生存的因素，高密度淋巴細(xì)胞浸潤是長生存的明確預(yù)測因素。

T細(xì)胞免疫反應(yīng)啟動需有二個信號：T細(xì)胞受體（TCR）識別MHC抗原肽段，受體與抗原遞呈細(xì)胞（APCs）上的配體相互作用形成共刺激信號。抑制T細(xì)胞受體的信號對T細(xì)胞活性影響巨大，腫瘤中浸潤的T細(xì)胞長期過多表達各種負(fù)調(diào)控免疫節(jié)點，如PD-1、LAG-3和TIM-3，導(dǎo)致CD8T細(xì)胞功能耗竭，對抗原刺激無反應(yīng)，不能增殖，無抗癌效應(yīng)功能，如細(xì)胞毒作用和分泌干擾素γ。

這些研究為發(fā)展靶向上述分子調(diào)節(jié)途徑的藥物提供了依據(jù)，這些藥物稱作節(jié)點抑制劑（CKI），理論上能增加抗癌免疫反應(yīng)。臨床研究已證實靶向PD-1/PD-L1的mAb能誘導(dǎo)多種類型腫瘤治療反應(yīng)，不過多數(shù)腫瘤中只有20%的患者獲益，接下來需要明確有治療反應(yīng)和無治療反應(yīng)患者之間存在哪些差別，發(fā)現(xiàn)可用于預(yù)測治療反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志。

有報道顯示腫瘤表達PD-L1和髓系細(xì)胞浸潤時療效更佳，雖然PD-L1是預(yù)測抗PD-1/PD-L1的標(biāo)志，但它并不理想，敏感性和特異性較差。Rivzi觀察到肺癌中高突變和有大量新抗原發(fā)生時對PD-1 mAb治療更敏感。

最近研究顯示因為免疫逃逸和大量表達CK相關(guān)蛋白，MSI腫瘤可能持續(xù)處于不良免疫微環(huán)境狀態(tài)。根據(jù)這一結(jié)果，2015年Le評估了抗PD-1 CKI（帕姆布羅珠）治療轉(zhuǎn)移性MSI腫瘤的療效，另一項2期研究評估了納武單抗（抗PD-1 mAb）±伊普利姆瑪（CTLA-4mAb）的療效，二項研究明確顯示MSI狀態(tài)可以預(yù)測CK阻滯治療的獲益，腫瘤是MSI表型時可能對PD-1阻滯治療獲益。

確定微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和誤配修復(fù)缺陷

歐洲的LS指南推薦，所有CRC患者均應(yīng)行免疫組化或PCR方法鑒定是否為LS；Mallorca小組推薦所有CRC均應(yīng)行免疫組化或PCR檢查，而且檢查時還要鑒別是否有MLH1啟動子甲基化，所有＜70歲的子宮內(nèi)膜癌都應(yīng)考慮免疫組化或PCR法檢查。2015年ESMO推薦所有CRC患者都要進行MSI和/DNA MMR缺陷檢查明確有無LS。

隨著PD-1抑制免疫治療在dMMR CRC中治療的成功，所有轉(zhuǎn)移性CRCs進行MMR或 MSI評估將成為必需進行的檢查。對于腫瘤標(biāo)本，MSI表型可通過PCR方法檢測，也可以通過免疫組化方法檢測MMR蛋白缺失，MMR蛋白包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2。

1、多聚酶鏈反應(yīng)

微衛(wèi)星是高度重復(fù)的1-6個核苷酸DNA序列，分布整個基因組，復(fù)制時經(jīng)常發(fā)生錯誤，MMR系統(tǒng)負(fù)責(zé)檢測修正微衛(wèi)星復(fù)制錯誤。PCR法檢測基因組微衛(wèi)星是標(biāo)準(zhǔn)的檢測MSI方法，百塞斯達指南最初推薦5個微衛(wèi)星組合標(biāo)準(zhǔn)，包括2個單核苷酸重復(fù)序列（BAT-25和BAT-26）和3個雙核苷酸重復(fù)序列（D2S123、D5S346和D17S250），檢測時比較正常組織和腫瘤組織中標(biāo)志物的長度，MSI表型至少要含有2個微衛(wèi)星不穩(wěn)定。

2002年Colle教授小組提出另一組5個單核苷酸重復(fù)序列檢測MSI，該組標(biāo)志無需同時分析非腫瘤DNA，該組標(biāo)志獲NCI批準(zhǔn)篩查MSI腫瘤，特異性和敏感性更好，2個不穩(wěn)定標(biāo)志將腫瘤定義為MSI表型。PCR法檢測MSI腫瘤表型的主要缺點是DNA腫瘤標(biāo)本可被正常組織DNA污染，此外腫瘤含量低也會影響結(jié)果，這一點在粘液性腫瘤中尤為突出。

Colle教授小組最近報道MSI CRC 中HSP110（HT17）的T17單核苷核重復(fù)序列高頻突變，腫瘤DNA缺失HT17重復(fù)序列導(dǎo)致HSP110異構(gòu)體合成增加。研究顯示明確是否為MSI時，HT17的敏感性更優(yōu)，因此HT17 DNA重復(fù)序列似乎對診斷CRC MSI表型更優(yōu)。

2、免疫組化

免疫組化方法可以研究MMR蛋白的表達情況，生理情況下MMR蛋白在核內(nèi)表達，較多表達于粘膜陷窩下1/3細(xì)胞，基質(zhì)炎癥細(xì)胞和上皮細(xì)胞中。MSI腫瘤細(xì)胞的雙等位基因失活時，免疫組化方法檢查時腫瘤細(xì)胞中MMR蛋白表達缺失。

腫瘤細(xì)胞核中MMR蛋白呈局限性的較弱染色，如果腫瘤細(xì)胞核中完全缺失某個MMR蛋白表達，就認(rèn)為是表達缺失，此時需內(nèi)對照陽性（基質(zhì)炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞核染色陽性），如果腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均無染色時，應(yīng)重復(fù)檢查。有時內(nèi)對照染色強于陽性的腫瘤細(xì)胞，應(yīng)行分子MSI分析證實是否為有缺陷的DNA MMR系統(tǒng)。

MMR蛋白的異二聚體形成功能體：MLH1與PMS2、MSH2與MSH6分別形成功能性二聚體復(fù)合物。MLH1和MSH2蛋白是二聚體的主導(dǎo)蛋白，PMS2和MSH6是配對蛋白，MLH1和MSH2突變可導(dǎo)致二聚體蛋白降解，致主導(dǎo)蛋白和配對蛋白表達缺失。MLH1和MSH2表達缺失相互排斥，只能有一種蛋白表達缺失。如果MLH1蛋白表達缺失，則同時伴有PMS2蛋白表達缺失，同理MSH2蛋白表達缺失導(dǎo)致MSH6同時表達缺失。

如果配對蛋白基因PMS2和MSH6突變，通常也可導(dǎo)致主導(dǎo)蛋白同時缺失，可能是因為與其它MMR系統(tǒng)成分如MSH3、MLH3和PMS1相互作用所致。雖不是絕對，但通常MSH2、MSH6和PMS2的缺失是胚系突變的證據(jù)，而MLH1蛋白缺失可能是MLH1胚系突變，也可能是啟動子甲基化所致，此外EPCAM組成性3’端缺失（MSH2基因上游）也可表觀沉默MSH2導(dǎo)致LS。MSH2表達陰性的患者也可以是MSH2雙體突變所致，與LS無關(guān)。

免疫組化方法價廉、耗時少，病理科常規(guī)用于檢測MMR蛋白。該技術(shù)很敏感，甚至可用于小腫瘤標(biāo)本檢測，而且可以鑒別受影響的MMR基因，指導(dǎo)胚系突變分析。早期MLH1和MSH2的研究顯示，在預(yù)測是否為胚系突變方面，免疫組化方法敏感性（85%）低于MSI（93%）。MMR蛋白缺失和MSI檢測結(jié)果的相關(guān)性很好，因此免疫組化方法可用作一線篩查。

免疫組化方法對篩查蛋白截短或降解突變很可靠，假陽性可見于錯義突變，它導(dǎo)致蛋白突變，酶促活性消失，但抗原性完整。直腸癌新輔助放化療后MSH6染色強度降低，因此免疫組化分析治療前內(nèi)鏡活檢標(biāo)本優(yōu)于手術(shù)標(biāo)本。此外組織標(biāo)本固定的異質(zhì)性也會降低免疫組化技術(shù)的敏感性。

Colle教授認(rèn)為要想獲取最佳結(jié)果，標(biāo)本應(yīng)在10%福爾馬林中固定，還應(yīng)時刻牢記免疫組化技術(shù)很難完全標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性相對差，所以免疫組化應(yīng)由有經(jīng)驗的病理專家進行，染色結(jié)果也應(yīng)與分子結(jié)果相對應(yīng)。

3.下一代基因測序

NGS已被用作診斷性方法檢測MSI腫瘤，主要依據(jù)如下假說：多基因組的突變負(fù)荷可明確排除pMMR腫瘤。Stadler的研究中對224例CRC患者進行NGS分析，當(dāng)腫瘤突變不足20（193例）時為pMMR腫瘤。31例≥20個突變CRC中，28例為dMMR，其余3例攜帶POLE突變，為過甲基化表型，突變超過150（dMMR腫瘤中位突變50）。

然而NGS仍僅限于高度專業(yè)的實驗室，需要高質(zhì)量的腫瘤和正常組織標(biāo)本。Stadler采用多基因組合分析，包括深度測序所有外顯子和341個癌癥相關(guān)基因的內(nèi)含子，以明確鑒別dMMR腫瘤的NGS基因組合和特異性突變負(fù)荷閾值。很快NGS將成為另一種用于區(qū)別pMMR 、dMMR和POLE突變腫瘤的方法。

MSI結(jié)直腸癌

1、流病學(xué)

MSI CRC 具有特異的臨床病理特征:近端結(jié)腸、分化差、粘液性成分、高水平炎癥浸潤。MSI CRC約占II和III期CRC的15%-20%，預(yù)后優(yōu)于pMMR腫瘤。II期dMMR CRC不適合使用氟脲嘧啶類化療，因為這類患者生存期長，化療作用不大。奧沙利鉑類化療仍是III期CRC標(biāo)準(zhǔn)治療，無論MMR狀態(tài)如何。

轉(zhuǎn)移性CRC中dMMR腫瘤只有5%，明顯低于II和III期腫瘤，說明dMMR CRC發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力較差，不過一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，dMMR狀態(tài)與預(yù)后差相關(guān)，在3063例IV期CRC患者中，dMMR腫瘤患者的無進展生存和總生存差于pMMR腫瘤患者。

dMMR CRC與BRAFV600E突變關(guān)系密切，35%的 BRAFV600E突變CRC發(fā)生于dMMR mCRC中，21%的dMMR CRC發(fā)生于BRAFV600E突變的mCRC。實際上dMMR和BRAFV600E突變在CMS1亞類中最多，CMS1亞類的特征是無病生存長，但復(fù)發(fā)后快速進展。BRAFV600E突變有助于判斷dMMR mCRC預(yù)后，此類患者預(yù)后不良，部分歸因于BRAFV600E突變。

3、散發(fā)和遺傳性dMMR結(jié)直腸癌

標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化和生物學(xué)標(biāo)志分析對區(qū)分散發(fā)dMMR和LS相關(guān)腫瘤很有幫助。dMMR CRC伴有MLH2/MSH6或孤立MSH6/PMS2表達缺失時應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是LS相關(guān)腫瘤，無論BRAF突變狀態(tài)如何。患者具有MMR組成性突變時可以存在BRAFV600E突變腫瘤。

dMMR CRC伴MLH1表達缺失時既可是散發(fā)也可是遺傳性，MLH1陰性CRC時應(yīng)分析BRAF突變狀態(tài)和MLH1啟動子甲基化狀態(tài)。散發(fā)MLH1陰性腫瘤可以是BRAFV600E突變和/MLH1啟動子過甲基化，而LS MLH1陰性CRC則是BRAF野生型、無MLH1啟動子過甲基化。已有流程用于區(qū)分dMMR CRC患者（圖1）。另有報道MLH1和MSH2基因可發(fā)生雙體突變dMMR CRC，非甲基化的MLH1陰性CRC和MSH2陰性腫瘤并不一定就是LS。

圖1鑒定散發(fā)CRC和LS相關(guān)腫瘤

3、免疫治療和dMMR結(jié)直腸癌

CK抑制是治療dMMR CRC很有前景的手段。Le的研究結(jié)果顯示帕姆布羅珠治療dMMR CRC的客觀反應(yīng)率40%，而pMMR為0%，進一步分析顯示dMMR腫瘤客觀反應(yīng)率（ORR）50% ，pMMR為0% ，dMMR組患者的中位無進展生存（PFS）和總生存（OS）尚未達到，而pMMR組只有2.4和6個月。目前3期研究正在比較帕姆布羅珠與化療一線治療dMMR mCRC。

dMMR mCRC患者也采用其它CKI治療評估。納武單抗是另一個抗PD-1 mAb，單獨（N3）或與伊普利姆瑪（抗CTLA-4 mAb）聯(lián)合（N3+I1）治療dMMR mCRC，療效良好（100例）。二組的ORR分別為25.5%和33.3%，均獲持續(xù)治療反應(yīng)，只有1例pMMR組患者獲部分緩解。N3和N3+I1組的中位PFS分別為5.3個月和尚未達到，中位OS分別為17.1個月和尚未達到。副反應(yīng)發(fā)生率可接受，無論BRAF和KRAS突變狀態(tài)以及PD-L1是否表達，均有臨床療效。

雖然在MSI腫瘤中尚未發(fā)現(xiàn)明確的生物學(xué)標(biāo)志，但MMR缺陷可看作是CKI有效的預(yù)測標(biāo)志，所以轉(zhuǎn)移性dMMR CRC患者應(yīng)當(dāng)接受相關(guān)檢查，因為患者可能有機會接受革新性的免疫治療。

MSI非結(jié)直腸癌

1、流病學(xué)

MSI非結(jié)直腸癌的流病數(shù)據(jù)很不完整，子宮內(nèi)膜癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、甲狀腺癌、黑色素瘤和皮脂腺腫瘤中MSI表型發(fā)生率較高，＞10%；卵巢癌、宮頸癌、食管腺癌、軟組織肉瘤、頭頸鱗癌、腎癌和Ewing's肉瘤也有MSI表型，發(fā)生率2%-10%；皮膚鱗癌或基底細(xì)胞癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌和骨肉瘤中MSI表型＜2%；MSI表型在非霍奇金淋巴瘤中發(fā)生率很低。

大約20 %-30%的子宮內(nèi)膜癌攜帶MMR缺陷，MSI子宮內(nèi)膜腫瘤表現(xiàn)為高級別、脈管瘤栓和淋巴侵犯。MSI表型可見于所有卵巢癌亞型中，與預(yù)后似乎并無關(guān)聯(lián)，較多見于子宮內(nèi)膜樣和粘液性癌，較少見于漿液性癌（主要與LS相關(guān)），LS時dMMR腫瘤多為低級別早期子宮內(nèi)膜樣癌。

MSI胃癌的了解甚少，幾項研究顯示MSI與較早分期、較大年齡和腸型胃癌有關(guān)。盡管MSI表型是免疫治療療效的很有前景的生物學(xué)指標(biāo)，不過MSI腫瘤的臨床和分子特征仍不甚清楚。

2、免疫治療和dMMR非結(jié)直腸癌

一項2期研究評估帕姆布羅珠治療非結(jié)直腸dMMR轉(zhuǎn)移性腫瘤的療效，包括子宮內(nèi)膜癌、壺腹癌、胰腺癌、小腸癌、胃癌、以及其它腫瘤。帕姆布羅珠療效良好，ORR為53%，9例完全緩解，7例部分緩解，1年P(guān)FS率和OS率分別為57%和81%。目前幾項研究正在進一步評估免疫治療療效，其中部分研究的入選標(biāo)準(zhǔn)要求腫瘤為MSI表型，而無需考慮原發(fā)腫瘤類型。

3、組成性誤配修復(fù)缺陷

MMR雙等位基因胚系突變的患者深受組成性MMR缺陷（CMMRD）之苦。這種罕見的綜合征（不足200例）與早期發(fā)作的腫瘤如CRC、腦瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病有關(guān)。CMMRD的特征是MMR缺陷，MSI表型存在于腫瘤細(xì)胞和永生的淋巴母細(xì)胞中。

CMMRD所致的多形性腦膠質(zhì)瘤是人類腫瘤中突變負(fù)荷最高的腫瘤?；加袕?fù)發(fā)多形性CMMRD 腦膠質(zhì)瘤的2兄弟接受納武單抗治療，療效顯著，治療反應(yīng)持久，而該病復(fù)發(fā)后通常生存不足6個月。CKI有可能成為CMMRD相關(guān)腫瘤治療的突破性進展。

結(jié)語

MMR 缺陷是癌癥的驅(qū)動改變，發(fā)生于多種人類腫瘤中，不論是散發(fā)還是遺傳性起源。MMR缺陷導(dǎo)致MSI表型，可通過免疫組化、PCR和NGS方法檢測。免疫CKI治療MSI/dMMR腫瘤療效很好，對MSS CRC無效，因此MSI表型和MMR缺陷可作為CKI有效的陽性預(yù)測標(biāo)志。MSI表型發(fā)生率高的腫瘤中應(yīng)強制檢查MSI和MMR狀態(tài)以指導(dǎo)治療，此外還需對MSI/dMMR腫瘤進行更系統(tǒng)的臨床研究。