實(shí)驗(yàn)一    微生物(酵母)的培養(yǎng)基優(yōu)化
(指導(dǎo)教師:汪文俊   熊海容  王海英  肖新才     實(shí)驗(yàn)員: 張繼泰)
一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>掌握微生物斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基確定方法，學(xué)會(huì)對(duì)已確定菌種確定實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工藝。
二．實(shí)驗(yàn)原理
生物量的測(cè)定方法有比濁法和直接稱重法等。由于酵母在液體深層通氣發(fā)酵過(guò)程中是以均一混濁液的狀態(tài)存在的，所以可以采用直接比色法進(jìn)行測(cè)定。
三．儀器與試劑
全恒溫振蕩培養(yǎng)箱，分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴槽、天平、電爐。試劑為葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、KH2PO4。
四．實(shí)驗(yàn)方法
(1)、培養(yǎng)基的配制(見表1,2)
表1   正交表試驗(yàn)設(shè)計(jì)
因素水平  葡萄糖  蔗糖  酵母膏  KH2PO4
1  1.0  0.0  0.5  0.5
2  2.0  1.0  1.0  1.0
3  3.0  2.0  2.0  2.0
表2   正交表實(shí)驗(yàn)方案
  編號(hào) 葡萄糖
(A)  蔗糖
(B)  酵母膏
(C)  KH2PO4
（D）  生物量 （OD）
     0h   12h 24h 36h 48h 60h
1  (1)  (1)  (1)  (1)       
2  (1)  (2)  (2)  (2)       
3  (1)  (3)  (3)  (3)       
4  (2)  (1)  (2)  (3)       
5  (2)  (2)  (3)  (1)       
6  (2)  (3)  (1)  (2)       
7  (3)  (1)  (3)  (2)       
8  (3)  (2)  (1)  (3)       
9  (3)  (3)  (2)  (1)       
（2）將上述培養(yǎng)基配制好以后，每250 ml三角瓶裝入培養(yǎng)基100 ml，于121℃下滅菌30 min，冷卻。
（3）冷卻后接種（接種量為5％），置于28℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
（4）測(cè)OD值：將接種0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同時(shí)間的菌懸液搖均勻后于560nm波長(zhǎng)、1cm比色皿中測(cè)定0D值。比色測(cè)定時(shí)，用以未接種的培養(yǎng)基作空白對(duì)照，并將0D值填入表中，最終確定最佳培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵時(shí)間。
五．思考題
 (1)比濁計(jì)數(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中有何應(yīng)用價(jià)值?
 (2)本實(shí)驗(yàn)為什么采用560nm波長(zhǎng)測(cè)定酵母菌懸液的光密度？如果你在實(shí)驗(yàn)中需要測(cè)定
大腸桿菌生長(zhǎng)的OD值，你將如何選擇波長(zhǎng)?
實(shí)驗(yàn)二   紫外線的誘變育種
    (指導(dǎo)教師:汪文俊   熊海容  王海英  肖新才     實(shí)驗(yàn)員: 張繼泰)
一．目的要求
通過(guò)實(shí)驗(yàn)，觀察紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌的誘變效應(yīng)，并學(xué)習(xí)物理因素誘變育種的方法。
二．基本原理
紫外線對(duì)微生物有誘變作用，主要引起是DNA的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體），從而引起菌體遺傳性變異。
三．菌種與儀器
菌種：枯草芽孢桿菌(產(chǎn)胞外淀粉酶)；
儀器：血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，紫外線燈（15W），電磁攪拌器，離心機(jī)
四．操作步驟
（1）菌懸液的制備
（a）取培養(yǎng)48小時(shí)的枯草芽孢桿菌的斜面4—5支，用無(wú)菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。
（b）將上述菌液離心（3000r/min，離心15分鐘），棄去上清液，將菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌2—3次，最后制成菌懸液。
（c）用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升108個(gè)。
（2）平板制作將淀粉瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至55℃左右時(shí)倒平板，凝固后待用。
（3）紫外線處理
（a）將紫外線燈開關(guān)打開預(yù)熱約20分鐘。
　?。╞）取直徑6cm無(wú)菌平皿2套，分別加入上述菌懸液5ml，并放入無(wú)菌攪拌棒于平皿中。
　?。╟）將盛有菌懸液的2平皿置于磁力攪拌器上，在距離為30cm，功率為15W的紫外線燈下分別攪拌照射1分鐘及3分鐘。
　　(4) 稀釋在紅燈下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6（具體可按估計(jì)的存活率進(jìn)行稀釋）。
　　(5)涂平板取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度涂平板3只，每只平板加稀釋菌液0．1ml，用無(wú)菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對(duì)照。
(6)培養(yǎng)
將上述涂勻的平板，用黑布（或黑紙）包好，置37℃培養(yǎng)48小時(shí)。注意每個(gè)平皿背面要標(biāo)明處理時(shí)間和稀釋度。
　　(7)計(jì)數(shù)將培養(yǎng)48小時(shí)后的平板取出進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，根據(jù)對(duì)照平板上菌落數(shù)，計(jì)算出每毫升菌液中的活菌數(shù)。同樣計(jì)算出紫外線處理1分鐘、3分鐘后的存活細(xì)胞數(shù)及其致死率。
 
 
(8)觀察誘變效應(yīng)
將細(xì)胞計(jì)數(shù)后的平板，分別向菌落數(shù)在5—6個(gè)左右的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值（HC值）。與對(duì)照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果，說(shuō)明誘變效應(yīng)。并選取HC比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復(fù)篩用。
五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1．結(jié)果
將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表。
稀釋倍數(shù)
平均菌落
處理時(shí)間     （數(shù)/皿）
誘變劑    （min） 10-4 10-5 10-6 存活率% 致死率%
紫外線
（UV） 0（對(duì)照）     
 1     
 3     

結(jié)果

處理 透明圈和菌落直徑大?。īL）及其HC比值
 1 2 3 4 5 6
 透明圈 菌

落 HC比值 透明圈 菌

落 HC比值 透明圈 菌

落 HC比值 透明圈 菌

落 HC比值 透明圈 菌

落 HC比值 透明圈 菌

落 HC比值
UV處理                  
對(duì)照                  
六．思考題
(1) 用于誘變的菌懸液（或孢子懸液）為什么要充分振蕩？
(2) 經(jīng)紫外線處理后的操作和培養(yǎng)為什么要在暗處或紅光下進(jìn)行？

實(shí)驗(yàn)三  玉米淀粉液化及糖化
(指導(dǎo)教師:汪文俊   熊海容  王海英  肖新才     實(shí)驗(yàn)員: 張繼泰)
一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>掌握用酶法從淀粉原料到水解糖的制備原理及方法。掌握粗淀粉含量和還原糖的化學(xué)測(cè)定方法。
二、 實(shí)驗(yàn)原理
發(fā)酵過(guò)程中，有些微生物不能直接利用淀粉，因此，當(dāng)以淀粉為原料時(shí)，必須先將淀粉水解成葡萄糖，才能供發(fā)酵使用。一般將淀粉水解為葡萄糖的過(guò)程稱為淀粉的糖化，所制得的糖液稱為淀粉水解糖。發(fā)酵生產(chǎn)中，淀粉水解糖液的質(zhì)量，與生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)速度及產(chǎn)物的積累直接相關(guān)。
    可以用來(lái)制備淀粉水解糖的原料主要有薯類(木薯、甘薯)淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉等，根據(jù)原料淀粉的性質(zhì)及采用的水解催化劑的不同，水解淀粉為葡萄糖的方法可分為酸解法、酸酶結(jié)合法和酶解法。實(shí)驗(yàn)室中常采用酶解法制備淀粉水解糖。
    酶解法是指利用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過(guò)程。酶解法制葡萄糖可分為兩步：第l步是利用α-淀粉酶將淀粉液化為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個(gè)過(guò)程稱為液化；第2步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^(guò)程，在生產(chǎn)上稱為糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下進(jìn)行的，故也稱為雙酶水解法。
2.1 酶法液化原理
淀粉的酶法液化是以α-淀粉酶為催化劑，該酶作用于淀粉的α-1,4糖苷鍵，從內(nèi)部隨機(jī)地水解淀粉，從而迅速將淀粉水解為糊精及少量麥芽糖，所以也稱內(nèi)切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，其碘色反應(yīng)發(fā)生如下變化：藍(lán)→紫→紅→淺紅→不顯色(即碘原色)。酶法液化以生產(chǎn)工藝不同分為間歇法，半連續(xù)和連續(xù)式；液化設(shè)備有：管式、罐式、噴射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。根據(jù)酶制劑的耐溫性分為中溫酶法、高溫酶法、或中溫酶和高溫酶混合法。本實(shí)驗(yàn)采用：高溫酶法，間歇式，罐式，二次加酶法。
2.2 酶法糖化原理
淀粉的糖化是以糖化酶為催化劑，該酶從非還原末端以葡萄糖為單位順次分解淀粉的α-1，4糖苷鍵或α-1，6糖苷鍵。因?yàn)槭菑逆湹囊欢酥饾u地一個(gè)個(gè)地切斷為葡萄糖，所以稱為外切淀粉酶。淀粉糖化的理論收率：因?yàn)樵谔腔^(guò)程中，水參與反應(yīng)，故糖化的理論收率為111.1％。
（C6H10O5)n+H2O        nC6H12O6      162      18            180淀粉糖化實(shí)際收率：
實(shí)際收率的計(jì)算公式：
淀粉轉(zhuǎn)化率：淀粉-葡萄糖轉(zhuǎn)化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被轉(zhuǎn)化為葡萄糖。
淀粉轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：
DE值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中還原性糖以葡萄糖計(jì)，占干物質(zhì)的百分比稱為DE值。
DE值計(jì)算：
還原糖用DNS法測(cè)定，濃度表示：葡萄糖g/100ml糖液；
干物質(zhì)用阿貝折光儀測(cè)定，濃度表示：干物質(zhì)g/100g糖液。
影響DE值的因素：
糖化時(shí)間：最初糖化時(shí)，糖化速度快，DE值顯著上升；但24h后，當(dāng)DE值達(dá)到90％以上時(shí)，糖化速度顯著放慢。
液化DE值與糖化DE值的關(guān)系：
液化程度應(yīng)控制適當(dāng)，太低或太高均不利。原因是液化程度低，則粘度大，難操作；同時(shí)，由于液化程度低，底物分子少，水解機(jī)會(huì)少，影響糖化速度；液化程度低，易發(fā)生老化；但液化超過(guò)一定程度，則不利于糖化酶與糊精生成絡(luò)合結(jié)構(gòu)，影響催化效率，造成糖化液的最終DE值低。故應(yīng)在碘試本色的前提下，液化DE值越低，則糖化液的最高DE值越高。一般液化DE值應(yīng)控制在12-18％。
酶制劑用量與糖液DE值的關(guān)系：
糖化時(shí)間與糖化酶用量關(guān)系表
糖化時(shí)間（h） 6 8 10 16 24 32 48 72
糖化酶用量（U/g淀粉） 480 400 320 240 180 150 120 100
為加快糖化速度，可以提高酶用量，縮短糖化時(shí)間。但酶用量太高，反而使復(fù)合反應(yīng)嚴(yán)重，最終導(dǎo)致葡萄糖值降低。在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)充分利用糖化罐的容量，盡量延長(zhǎng)糖化時(shí)間，減少糖化酶用量。
糖化酶參考用量：液化DE值17％，淀粉乳33％，60℃，pH4.5，酶制劑240U/g絕干淀粉。糖化時(shí)間16h。
三、 實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備和材料
（1）25升罐 ；（2）小型板框過(guò)濾機(jī)壓濾；（3）烘箱；（4）水桶；（5）量筒；（6）分光光度計(jì)；（7）水浴鍋；（8）滴定管；（9）電爐；（10）白瓷板；（11）三角瓶；（12）阿貝折光儀；（13）玉米粉；（14）高溫α-淀粉酶；（15）糖化酶；（16）pH試紙；
四、實(shí)驗(yàn)方法
4.1 淀粉的液化
配制30％的淀粉乳（按15升配制），調(diào)節(jié)pH值至6.5，加入氯化鈣(對(duì)固形物0.2％)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在劇烈攪拌下，先加熱至72℃，保溫15min，再加熱至90℃，并維持30min，以達(dá)到所需的液化程度(DE值：15-18％)，碘反應(yīng)呈棕紅色。液化結(jié)束后，再升溫至120℃，保持5-8min，以凝聚蛋白質(zhì)，改進(jìn)過(guò)濾。
4.2 淀粉的糖化
液化結(jié)束后，迅速將料液用煙酸將pH調(diào)至4.2-4.5，同時(shí)迅速降溫至60℃。加入糖化酶，60℃保溫若干小時(shí)后，當(dāng)用無(wú)水酒精檢驗(yàn)無(wú)糊精存在時(shí)。將料液pH調(diào)至4.8-5.0，同時(shí)，將料液加熱至80℃，保溫20min．然后將料液溫度降至60-70℃，開始過(guò)濾。
4.3 過(guò)濾
在發(fā)酵罐內(nèi)將料液冷卻至60-70℃；洗凈板框過(guò)濾機(jī)，裝好濾布；接好板框壓濾機(jī)的管道；泵料過(guò)濾；熱水洗滌(60-70℃)；空氣吹干；過(guò)濾結(jié)束后，洗凈過(guò)濾機(jī)及有關(guān)設(shè)備。量取糖液體積；取樣分析還原糖濃度。
五、數(shù)據(jù)處理
在詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。計(jì)算淀粉轉(zhuǎn)化率。
六、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
糖化酶用量及糖化時(shí)間對(duì)糖化效果的影響；
液化和糖化時(shí)溫度及pH對(duì)實(shí)驗(yàn)效果的影響。

附錄1
1、殘?zhí)呛繙y(cè)定
3,5-二硝基水楊酸比色定糖法
一、原理：
本實(shí)驗(yàn)是利用3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物．在一定范圍內(nèi)還原糖的量和棕紅包物質(zhì)顏色深淺的程度成—定比例關(guān)系．可用于比色測(cè)定。葡萄糖與3,5-二硝基水楊酸試劑反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在520 nm處有最大吸收峰，故在此波長(zhǎng)下進(jìn)行比色。
二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1． 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
取6支大試管，從0~5分別編號(hào)，按下表加入各種試劑。
試劑 管  號(hào)
 0 1 2 3 4 5
1mg/mL葡萄糖溶液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸餾水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
DNS試劑（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
將各管溶液振蕩混勻后，在沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5 min，取出迅速用冷水冷卻至室溫，加入蒸餾水15 mL，搖勻。在520 nm波長(zhǎng)下，用空白調(diào)零測(cè)定吸光值，測(cè)定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2． 樣品測(cè)定
取培養(yǎng)基5 mL，5000 r/min離心5 min，取上清液1 mL于試管中，加入0.5 mL DNS試劑，同以上操作，測(cè)吸光值，用Origin軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出各個(gè)時(shí)期樣品的葡萄糖含量。
實(shí)驗(yàn)四  淀粉酶的固定化生產(chǎn)
(指導(dǎo)教師:汪文俊   熊海容  王海英  肖新才     實(shí)驗(yàn)員:張繼泰)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>學(xué)習(xí)細(xì)胞固定化的原理，通過(guò)海藻酸鈉包埋固定產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌，掌握菌體包埋固定的基本方法，了解固定化細(xì)胞在實(shí)際中的應(yīng)用。
二、 實(shí)驗(yàn)原理：
細(xì)胞固定化克服了傳統(tǒng)游離細(xì)胞發(fā)酵的不足，本實(shí)驗(yàn)以海藻酸鈉為載體，以CaCl2為交聯(lián)劑，進(jìn)行固定化枯草芽孢桿菌。海藻酸鈉是從海藻提取獲取的藻酸鹽，為D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的線性共聚物，多價(jià)陽(yáng)離子（如Ca2+）可誘導(dǎo)凝膠。
三、 實(shí)驗(yàn)材料：
1.菌株：枯草芽孢桿菌。
2.發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖：4%；蛋白胨：1%；磷酸二氫鉀：0.5%；七水硫酸鎂：0.2%酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。
3.固定化用培養(yǎng)基：淀粉：2％；葡萄糖：0.5%；蛋白胨：1%；磷酸二氫鉀：0.5%；七水硫酸鎂：0.2%；酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。
四、實(shí)驗(yàn)步驟：
（1）培養(yǎng)基滅菌：取250mL三角瓶，分別放入配好的液體培養(yǎng)基100ml，滅菌冷卻。
（2）種子活化和接種：將枯草芽孢桿菌接入培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)活化，取活化后的枯草芽孢桿菌分別接入已滅菌冷卻的三角瓶培養(yǎng)瓶，振蕩混勻。
（3）培養(yǎng)：將已接種的三角瓶培養(yǎng)液置于振蕩培養(yǎng)箱，200r/min，25℃培養(yǎng)三天，離心收獲菌體并用無(wú)菌水洗滌一次，制備菌懸液，使其中枯草芽孢桿菌菌數(shù)為2.3×107個(gè)/ml。
（4）海藻酸鈉及交聯(lián)劑的制備：
海藻酸鈉溶液的制備：取海藻酸鈉1.5g，2.0g，2.5g，3.0g，3.5g，分別置于250ml三角瓶中，各加入100ml蒸餾水，放置并攪拌，滅菌。
交聯(lián)劑的制備：配制2%濃度的CaCl2，滅菌。
（5）固定化枯草芽孢桿菌的制備
將枯草芽孢桿菌細(xì)胞菌懸液與海藻酸鈉溶液按照1∶1 充分混勻后,用一注射器,將混合液滴入交聯(lián)劑中, 交聯(lián)劑的陽(yáng)離子從外部擴(kuò)散進(jìn)入海藻酸鈉枯草芽孢桿菌混合液珠內(nèi), 將細(xì)胞包埋其中。制成凝膠小球，使酵母固定化，用無(wú)菌水洗滌固定化細(xì)胞，然后加入2% CaCl2，平衡24 h即可使用。
（6）固定化細(xì)胞的增殖：將固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)入固定化增殖培養(yǎng)基25℃，pH6下培養(yǎng)。
5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
   利用DNS法檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，以確定是否產(chǎn)生了淀粉酶，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)，滴入碘液，看是否有藍(lán)色產(chǎn)生。
六、思考題
1、固定化細(xì)胞有何優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？
2、對(duì)細(xì)胞或者酶進(jìn)行固定的方法還有哪些？

實(shí)驗(yàn)五    發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵研究
(指導(dǎo)教師:汪文俊   熊海容  王海英  肖新才     實(shí)驗(yàn)員: 張繼泰)
一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>加深對(duì)培養(yǎng)方法的認(rèn)識(shí)，了解補(bǔ)料分批續(xù)培養(yǎng)過(guò)程控制方法。
二．實(shí)驗(yàn)原理
補(bǔ)料分批培養(yǎng)，是一種介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的過(guò)渡培養(yǎng)方式，是在分批培養(yǎng)的過(guò)程中，間隙或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。流加培養(yǎng)同時(shí)兼有間歇培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)的某些特點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)是，可使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的底物濃度，減少底物的抑制或其分解代謝物的阻遏作用，不會(huì)出現(xiàn)當(dāng)某種培養(yǎng)基成分的濃度高時(shí)影響菌體得率和代謝產(chǎn)物生成速率的現(xiàn)象。
三．菌種與培養(yǎng)基
1.啤酒酵母
2．培養(yǎng)基(g/L)
葡萄糖20，酵母浸粉 5.0，KH2PO4 3.0，Na2HP04 1.0，MgSO4  1.0，pH 5.0。流加的濃葡萄糖液質(zhì)量濃度為25 g／100 ml。保持培養(yǎng)基中糖的質(zhì)量濃度在0.5 g/L，流加液的糖的質(zhì)量濃度為25—30 g/100 m1。
四．實(shí)驗(yàn)方法
1．流加培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作 
在培養(yǎng)罐中加入去離子水，將溫度傳感器、除菌過(guò)濾器安裝好，用硅橡膠管連接好取樣口、流加液入口，不需要的接口全部封好。橡膠管用彈簧夾夾住，排氣口用一小段棉花塞好。確認(rèn)所有連接沒有問(wèn)題后，打開通風(fēng)排氣系統(tǒng)，檢查是否有漏氣、阻塞現(xiàn)象(輕輕堵住排氣口，看其他地方是否漏氣)，確認(rèn)正常。
2.種子培養(yǎng)
自斜面菌種挑起一環(huán)啤酒酵母菌體。接入裝有50ml 培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，搖勻后，置于24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h。將上述培養(yǎng)好的液體種子接入用250ml三角瓶裝的滅過(guò)菌的100ml液體培養(yǎng)基中，接種量10％，在24℃下培養(yǎng)36h。
3．流加培養(yǎng)   
培養(yǎng)罐中加入已調(diào)配好的培養(yǎng)基后，放在滅菌鍋中滅菌121℃，20－30 min，葡葡糖和消泡劑分別同時(shí)滅菌。培養(yǎng)罐取出后，開通冷卻水進(jìn)行冷卻，同時(shí)開動(dòng)攪拌器，通入無(wú)菌壓縮空氣以防產(chǎn)生負(fù)壓,冷卻到發(fā)酵溫度25 ℃。利用硅皮管將25 g/100m1葡萄糖液貯瓶和0.1 mol/L氨液貯瓶分別連接蠕動(dòng)泵和培養(yǎng)罐上的入口，再將兩個(gè)貯瓶上的排氣口塞上棉花用彈簧夾夾住。消泡劑貯瓶排氣口塞上錦花。如果傳感器不能用蒸汽加壓滅菌，可以在室溫下把傳感錫在75％酒精中浸泡加進(jìn)行滅菌，然后用無(wú)菌水洗凈，盡快安裝在培養(yǎng)罐上。通氣量在3—5 L/min，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)在200～600rpm接種量10％。開動(dòng)蠕動(dòng)泵流加25g/100mL葡萄糖，使發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖濃度達(dá)到20～30g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培養(yǎng)掖pH為5.0。通過(guò)調(diào)節(jié)風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)數(shù)控制溶氧濃度在10％左右。流加培養(yǎng)7—10h，每隔0.5-1h取樣測(cè)定培養(yǎng)液中葡萄糖濃度、菌體量和副產(chǎn)物乙醇濃度。取樣口經(jīng)常用75％的酒精浸泡以保持清潔。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液進(jìn)行蒸汽加壓滅菌棄去。清洗培養(yǎng)罐。在發(fā)酵過(guò)程中消泡劑應(yīng)盡量少加。
四．分析方法
1．菌體量(X) 生物量的測(cè)定
生物量的測(cè)定方法有比濁法和直接稱重法等。本實(shí)驗(yàn)采用比濁法。以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，在550 nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光值。
五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）畫出培養(yǎng)液中酵母菌體量(g/L)隨流加培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線。
（2）計(jì)算酵母細(xì)胞的產(chǎn)率(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，葡萄糖)。
六．思考題
1、試分析補(bǔ)料分批發(fā)酵在工業(yè)上應(yīng)用情況？
2、在發(fā)酵過(guò)程中可采用哪些措施以增加酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)？
附錄2
生物量測(cè)定
一、原理
細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量增加和體積的增大，在一定條件下，單細(xì)胞生物細(xì)胞質(zhì)量的多少和細(xì)胞的數(shù)量存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，據(jù)此測(cè)定生長(zhǎng)過(guò)程中菌體含量的變化可以近似表示細(xì)胞數(shù)量的變化。
二、實(shí)驗(yàn)步驟：
先稱取干燥的空離心管重量，記為W1，取5 mL發(fā)酵液于離心管，5000 r/min離心5 min，上清液保存于冰箱進(jìn)行糖濃度測(cè)定，菌體和離心管一起于85℃烘至恒重后稱離心管和菌體重量，記為W2，根據(jù)下式計(jì)算不同時(shí)間的菌體生物量，單位 g/L。
 
實(shí)驗(yàn)六   機(jī)械攪拌罐培養(yǎng)酵母的動(dòng)力學(xué)模型建立
(指導(dǎo)教師:汪文俊   熊海容  王海英  肖新才     實(shí)驗(yàn)員: 張繼泰)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的：
①學(xué)習(xí)和掌握發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)檢測(cè)；
②掌握發(fā)酵罐的操作；
③掌握發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)模型的建立方法
內(nèi)容：
①類胡蘿卜素發(fā)酵過(guò)程生物量、產(chǎn)物和底物消耗數(shù)據(jù)測(cè)定；
②建立相關(guān)生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物生成的動(dòng)力學(xué)模型
二、實(shí)驗(yàn)原理：
通過(guò)發(fā)酵過(guò)程測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，依據(jù)一定的通用、經(jīng)典參考模型，建立適合某一特定微生物發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型。
三、實(shí)驗(yàn)步驟：
(一)、獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
1. 菌種：粘紅酵母4℃保藏于PDA斜面。
2. 培養(yǎng)基
1.1 PDA培養(yǎng)基：稱取新鮮土豆200 g，切絲放進(jìn)燒杯，加入約500 ml自來(lái)水，于電爐上加熱至沸騰，煮沸30 min后用兩層紗布過(guò)濾，收集濾液加入20～30 g葡萄糖，加水至1 L，pH值自然。(斜面制備時(shí)加入16～20 g瓊脂條)
1.2 種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、酵母浸粉5、KH2PO4 2、Na2HPO4  1、MgSO4 2，自來(lái)水配制，pH 5.0。
1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50、酵母浸粉5、(NH4)2SO4 6、KH2PO4 6、Na2HPO4 1、MgSO4 5, pH值自然。
3.培養(yǎng)方法
3.1菌種活化
將一滿環(huán)斜面保存粘紅酵母菌接種于新鮮PDA斜面，25~28℃培養(yǎng)24h。
3.2種子制備
接種二環(huán)活化的斜面菌種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，22℃、200 r/min下培養(yǎng)48 h作為種子液。
3.3發(fā)酵罐發(fā)酵
按1.2.3制備發(fā)酵培養(yǎng)基，每個(gè)5 L發(fā)酵罐裝入培養(yǎng)基2.5 L (即工作體積2.5L)，裝好發(fā)酵罐送于臥式滅菌鍋0.1 MPa滅菌15～20 min，取出發(fā)酵罐待冷卻至26℃后將上述種子培養(yǎng)基200 mL在火焰保護(hù)下接種到發(fā)酵罐中，在通氣量為0.1vvm、22℃下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔8 h取樣一次進(jìn)行酵母生物量、葡萄糖殘留量和類胡蘿卜素生成量的分析，培養(yǎng)80 h實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
1.3.3取樣與分析方法見附錄1至3
(二)、動(dòng)力學(xué)模型選擇
按照經(jīng)典的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，對(duì)于牛頓性流體發(fā)酵的本實(shí)驗(yàn)，在滿足這些模型的假設(shè)條件下選擇如下動(dòng)力學(xué)模型的速率函數(shù)作為本實(shí)驗(yàn)的參考模型
           （1）
           （2）
     （3）
      （4）
(三)、生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型建立
采用Metlab 7.01軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，求取上述模型中的μmax、α、β、Ks，將模型簡(jiǎn)化，代入上述模型中，將上述各式積分，聯(lián)合求解即可求得發(fā)酵過(guò)程中生物量、類胡蘿卜素產(chǎn)量和底物消耗與發(fā)酵時(shí)間的函數(shù)關(guān)系X=M(t)、Q=N(t)和S=L(t)，模型建立完成。

測(cè)定方法
1、 生物量測(cè)定參見實(shí)驗(yàn)三附錄2。
2、 殘?zhí)菧y(cè)定參見附錄1。
附錄3
類胡蘿卜素含量測(cè)定
取5 mL發(fā)酵液6000 r/min離心8 min，蒸餾水洗滌、離心三次，加入二甲亞砜(DMSO) 3 mL，用玻棒將菌體攪拌至菌體溶解于DMSO中，6000 r/min離心8 min，收集上清液于試管中，離心管中再次加入二甲亞砜(DMSO) 3 mL，用玻棒將菌體攪拌至菌體溶解于DMSO中，6000 r/min離心8 min，合并提取液，如此多次直至菌體無(wú)色。分光光度計(jì)于480 nm處比色，測(cè)定總類胡蘿卜素含量。
總類胡蘿卜素計(jì)算公式：
類胡蘿卜素含量(mg/L)＝1250×Vf×OD480
     式中：     Vf  -- 提取液體積；
                OD480—類胡蘿卜素480 nm處吸光值。

實(shí)驗(yàn)七 (趣味實(shí)驗(yàn))   用純根霉、酵母制作甜米酒
甜米酒亦即醪槽兒，它是用米飯和甜酒曲混合，保溫一定時(shí)間制成的。其中起主要作用的是甜酒曲中的根霉和酵母兩種微生物。根霉是藻菌綱、毛霉目、毛霉科的一屬，它能產(chǎn)生糖化酶，將淀粉水解為葡萄糖。根霉在糖化過(guò)程中還能產(chǎn)生少量的有機(jī)酸（如乳酸）。甜酒曲中少量的酵母菌，則利用根霉糖化淀粉所產(chǎn)生的糖酵解為酒精。所以，甜米酒既甜又微酸還醇香，口感舒適、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們喜愛。
人們通常采用市售酒曲制作甜米酒。由于市售酒曲質(zhì)量不夠穩(wěn)定，以致使甜米酒的風(fēng)味變化較大，有時(shí)甚至制作失效，造成浪費(fèi)。鑒于這種情況，我們?cè)谥笇W(xué)生進(jìn)行課外活動(dòng)時(shí)，根據(jù)甜米酒的制作原理，采用純根霉、酵母發(fā)酵米飯，從而獲得風(fēng)味純正、穩(wěn)定的甜米酒。通過(guò)該活動(dòng)，既使學(xué)生知道甜米酒的制作原理和制作過(guò)程，獲得一些微生物學(xué)知識(shí)和操作技能，又為甜米酒的大規(guī)模生產(chǎn)以及深加工提供一些參考。
1．材料與方法
1．1 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)我們使用的菌種是來(lái)自中科院成都生物所的根霉3．866，酒酵母1308（1）根霉培養(yǎng)：取大米20g，水60ml，分裝幾支大試管中，置0．1MPa滅菌15min。冷卻后，在接種箱內(nèi)接少量菌絲和孢子于米粒上，28～30℃培養(yǎng)30h左右，待其長(zhǎng)出大量孢子時(shí)取出備用。
（2）酵母培養(yǎng)：取濃度為13°B×麥芽汁，按需量取6N硫酸調(diào)節(jié)PH值至4．1～4．5。取50ml裝入100ml三角瓶中，置0．1Mpa滅菌30min。冷卻后，在接種箱內(nèi)將斜面酵母接1～2環(huán)于三角瓶中，28～30℃培養(yǎng)20～24h。
1．2 甜米酒的制作
將大米2kg加水浸泡4～8h，待手捏米粒即碎散時(shí)，用紗布控干水分，放入帶屜的鍋中蒸30～40min，即成松散的米飯。一般食堂賣的撈后蒸的米飯也可以，但要分散成粒。待米飯冷卻后，分裝9個(gè)同樣大的飯盒內(nèi)，每盒裝200g左右，隨意分成A、B、C三組，用3種不同的方式同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：
（1）市售酒曲（對(duì)照）：在A組的每個(gè)飯盒內(nèi)，加入1g酒曲（若是塊狀則研成粉末）與米飯混勻，使其中的根霉孢子分散在全部米飯中。再用干凈的匙壓平表面，中間留一凹洞，蓋上蓋，放入27～30℃環(huán)境中。12h后，每隔5h開蓋觀察，看米飯是否結(jié)團(tuán)變軟、變甜，凹洞中是否有水出現(xiàn)。如果米飯變軟，表示已糖化好；有水有酒香味，表示已有酒精，即可停止保溫。這時(shí)最好再蒸一次，殺死其中的微生物和停止酶活動(dòng)，以便放置取食。
（2）先用根霉糖化，后用酵母發(fā)酵：取大試管中的純根霉菌種3g，加少量冷開水搗成根霉糟液，平均放入B組的3個(gè)飯盒內(nèi)，與米飯混勻后，按（1）所述處理。當(dāng)米飯結(jié)團(tuán)變軟、變甜時(shí)，再向每個(gè)飯盒內(nèi)加酵母液1ml，封蓋，待有酒味時(shí)，再行殺菌，放置取食。
（3）根霉與酵母混合：按（1）所述操作。所不同的是，在C組的每個(gè)飯盒內(nèi)，同時(shí)加入1g純根霉菌種和1ml酵母液。
1．3 觀察記錄 在保溫12h后，每隔5h進(jìn)行觀察記錄。記錄內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)方式、觀察時(shí)間、米飯變化情況、口味等。上述3種方式保溫時(shí)間均為30～35h。其中方式（1）米飯結(jié)團(tuán)較差，較甜，微酸。酒味較濃，略帶澀味；（2）保溫30h左右，米飯變軟，凹洞有清水（純甜），加入酵母2h左右有酒味，結(jié)團(tuán)好，氣泡少，甜、微酸、醇香、味道純正；（3）米飯結(jié)團(tuán)好，較甜，微酸，酒味濃。