所有的液體培養(yǎng)基需用磷酸緩沖液配制：Na2HPO4-7H2O, 10.19g/L, NaH2PO4-H2O 8.56g/L. 稱量好所需組分，先把氨基酸、氮源等添加到水中，再添加糖最后添加10X的磷酸緩沖液。液體培養(yǎng)基的PH需在6.25左右。 液體選擇培養(yǎng)基和豐富培養(yǎng)基可以選擇過(guò)濾除菌，但是瓊脂平板培養(yǎng)基必須高壓滅菌 豐富非選擇培養(yǎng)基 2 x (YEPD or) YPD = Yeast Extract Peptone Dextrose 20g酵母粉 yeast extract(OXOID LP0021) 40 g 蛋白胨peptone (OXOID LP0042) 40g葡萄糖 dextrose**(國(guó)藥 14434-43-7) 把除葡糖糖之外的所有組分加入500ml水中溶解，定容至900ml，高壓滅菌 配置20%的葡萄糖過(guò)濾除菌，添加100ml。 室溫保存1-2個(gè)月。 **也可以所有組分一起滅菌，但是可能會(huì)發(fā)生焦化作用，然而焦化作用不會(huì)引起任何問(wèn)題。 生長(zhǎng)選擇合成培養(yǎng)基(Selective growth Synthetic Media) 2x (SD – CAA) 1)用于EBY100菌株配套 pYD 系列載體，或者二配體酵母配套pPNL20 和pPNL30 載體 10 g/L 酪蛋白水解物casamino acids (-ade, -ura, -trp)(庫(kù)存貨號(hào)：Fluka A2427-250G) 40g/L 葡萄糖dextrose(國(guó)藥 14434-43-7) 14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (SIGMA Y0626) 5.4 g/L Na2HPO4(國(guó)藥10039-32-4) 7.4 g/L NaH2PO4(國(guó)藥14431-43-7) 44 2)用于YVH10 with pPNL30系列載體 10 g/L 酪蛋白水解物(casamino acids (-ade, -ura, -trp) 40g/L 葡萄糖dextrose 14g/L YNB (Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids )40mg/L色氨酸( tryptophan) 5.4 g/L Na2HPO4 7.4 g/L NaH2PO4 3)用于JAR with pPNL20系列載體 10 g/L 酪蛋白水解物(casamino acids (-ade, -ura, -trp) (BD Bacto #223050) 40g/L 葡萄糖dextrose 14g/L YNB (Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids ) (BD Difco 233520) 20mg/L 尿嘧啶 Uracil 5.4 g/L Na2HPO4 7.4 g/L NaH2PO4 Selective scFv (or Fab or ligand) Induction Media 抗體scFv (or Fab or 配體)的選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)基 2x (SG-CAA) 10 g/L酪蛋白水解物casamino acids (-ade, -ura, -trp) (BD Bacto #223050) 2 g/L半乳糖 galactose 2 g/L棉子糖 raffinose 0.1 g/L葡萄糖 glucose 14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (BD Difco 233520) 5.4 g/L Na2HPO4 7.4 g/L NaH2PO4 YEPGR or YPGR = Yeast Extract Peptone Galactose/Raffinose 10g 酵母粉yeast extract 20 g 蛋白胨peptone 2%半乳糖 galactose 2%葡萄糖 raffinose 14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (BD Difco 233520) 5.4 g/L Na2HPO4 7.4 g/L NaH2PO4 尿嘧啶和色氨酸母液的配置 色氨酸配制成4mg/ml的100X的母液，過(guò)濾除菌 尿嘧啶配制成2mg/ml的100X的母液，過(guò)濾除菌 酵母培養(yǎng)基的配置和選擇 培養(yǎng)基的種類：應(yīng)用最廣泛的釀酒酵母培養(yǎng)基是YPD培養(yǎng)基(酵母粉、蛋白胨、葡萄糖)，單克隆在YPD上的生長(zhǎng)通常受尿嘧啶、精氨酸和色氨酸的限制。額外的添加這些組分克隆的形成將會(huì)加快加大。合成培養(yǎng)基由鹽(基本氮源和硫酸胺)碳源(比如葡萄糖)和其他組分(核苷酸和氨基酸)組成。合成培養(yǎng)基可以用drop in” 或者“drop out” 的策略篩選特定原養(yǎng)型菌株 “Drop out” 這種培養(yǎng)基是成分確定的營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其中添加很多氨基酸和核苷酸來(lái)支持菌株的生長(zhǎng)。菌株可以在這種培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)，接近在YPD平板上的生長(zhǎng)速度，“Drop out”培養(yǎng)基通常稱為完全合成培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱SC，缺失某一種氨基酸或者核苷酸可以選擇特定的原養(yǎng)型。 “Drop in”培養(yǎng)基僅包括基本的組分(鹽和湯)和菌株生長(zhǎng)所需的特定氨基酸和核苷酸。菌株必須用這些需分合成大部分生長(zhǎng)所需的前體?！癉rop in”培養(yǎng)基通常稱為葡萄糖合成培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱SD。簡(jiǎn)單的組分降低了成本并且容易配置，但是克隆形成時(shí)間將會(huì)慢兩倍。并且SD培養(yǎng)基不易保存(4℃放置兩個(gè)月即失效) 酵母菌株可以以穿刺菌、液體飽和培養(yǎng)物、平板的形式保存，有些時(shí)候甚至可以保存在Whatman濾紙上。收到菌株后最好搖一批新鮮的菌液凍存甘油菌。雖然酵母可以在4℃平板上放置幾個(gè)月仍然可以存活，然而存活的菌株多樣性卻在下降。為了避免部分菌株的富集導(dǎo)致群體性質(zhì)與原來(lái)相比出現(xiàn)偏離，接到菌株后需要馬上凍存。 在某些時(shí)間驗(yàn)證至少兩個(gè)克隆的選擇標(biāo)記是很有必要的。 你會(huì)注意到，有一些微小菌落(通常占群體的1 -10%)在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢(在非發(fā)酵性碳源培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，比如葡萄糖)。這些微小菌落在YPD培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型的牛奶白色，而正常的克隆則呈奶油色。這種現(xiàn)象可以通過(guò)保存甘油菌避免 酵母菌株可以在含15%甘油的YPD中保存數(shù)年，不需在干冰/乙醇上快速冷凍。要確保冷凍前菌液和甘油培養(yǎng)基混合均勻。 需用新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞凍存菌種，可以從固體平板上挑取菌落凍存(挑取火柴頭大小的一塊)或者取液體培養(yǎng)的菌株(離心取大約5 x 107 個(gè)細(xì)胞)?？梢灾苯訌倪x擇培養(yǎng)基上取菌株用YPD/甘油凍存 第二部分 酵母細(xì)胞的培養(yǎng)和scFv/Fab/toxin agment/ligand的誘導(dǎo)表達(dá) 1. 從-80取甘油菌劃SD-CAA(轉(zhuǎn)化菌或者二配體酵母)或者YPD(只限野生型菌株)，30度培養(yǎng)2d，挑取單克隆。接種2-5ml SD-CAA or YPD(野生型菌株培養(yǎng)，用于轉(zhuǎn)化)250rpm，30℃，培養(yǎng)過(guò)夜。 2. 過(guò)夜培養(yǎng)菌OD600應(yīng)該在1-3之間，即使在豐富培養(yǎng)集中也不會(huì)超過(guò)7，在選擇培養(yǎng)基中不會(huì)低于1。在倒置顯微鏡中觀察菌株的狀態(tài)和是否被污染 3. 如果沒(méi)有污染菌株?duì)顟B(tài)良好，用1.5ml eppendorf 離心管13000rpm離心1-2min或者用15 ml fulcon 管3000rpm離心5min 4. 對(duì)于scFv or Fab的誘導(dǎo)展示，用SG-CAA重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至OD600 = 1-2，18℃，250rpm，搖24-48h。 5. 離心收集細(xì)胞，用FACS緩沖液沖洗，用Alexia 488 labeled Anti-SV5 antibody在流式細(xì)胞儀(LSA II or Aria).檢測(cè)scFv/Fab的表達(dá) 6. 對(duì)于文庫(kù)構(gòu)建或者單克隆的轉(zhuǎn)化，參照LiAc 轉(zhuǎn)化方法 (part 5 or 6) |
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