【原】MPB：浙大王謙組-??菌酶一體化重組酵母工程菌的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

宏基因組 2021-01-10

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菌酶一體化重組酵母工程菌的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

Design and Construction of Recombinant Yeast with

Surface-displayed Enzymes

王謙*，王佳堃，高德英

奶業(yè)科學(xué)研究所，動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江大學(xué)，杭州，浙江

*通訊作者郵箱: emirate14@zju.edu.cn

摘要：實(shí)驗(yàn)原理：外源蛋白通過釀酒酵母α凝集素展示在細(xì)胞表面。α凝集素包含核心亞基AGA1及結(jié)合亞基AGA2。AGA1與酵母細(xì)胞壁β-葡聚糖共價(jià)連接，并通過兩個(gè)二硫鍵與AGA2的N端共價(jià)相連。外源蛋白與AGA2的C端融合，從而實(shí)現(xiàn)外源蛋白在釀酒酵母細(xì)胞的表面展示。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^AGA1和AGA2將外源蛋白固定在酵母細(xì)胞表面，獲得菌酶一體化的微生物細(xì)胞反應(yīng)器。

關(guān)鍵詞：α凝集素，外源蛋白，表面展示，釀酒酵母

材料與試劑

1.蓋玻片 (上海生工公司, catalog number: F518117)

2.載玻片 (上海生工公司, catalog number: F518110)

3.FALCON流式上樣管 (BD, catalog number: 352003)

4.離心管

5.各種型號(hào)槍頭

6.酵母提取物 (BBI Life Sciences, catalog number: A610961)

7.胰蛋白胨 (BBI Life Sciences, catalog number: A650217)

8.NaCl (BBI Life Sciences, catalog number: A610476)

9.瓊脂粉Agar (上海生工公司, catalog number: A505255)

10.瓊脂糖Agarose M (上海生工公司, catalog number: A610013)

11.pfu DNA聚合酶 (上海生工公司, catalog number: B500014)

12.PCR產(chǎn)物純化試劑盒 (上海生工公司, catalog number: B518141)

13.DNA Marker: GeneRuler^TM 100 by Plus DNA Ladder (Thermo Scientific^T^M, catalog number: SM0323)

14.限制性核酸內(nèi)切酶 (Thermo Scientific^T^M, 中國(guó))

15.Trelief^T^M SoSoo Cloning Kit (SoSoo, catalog number: TSV-S2)

16.Taq DNA聚合酶 (上海生工公司, catalog number: B500010)

17.質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I (OMEGA, catalog number: D6943-02)

18.釀酒酵母EBY100 (杭州余杭紫耕生物科技服務(wù)部)

19.pYD1質(zhì)粒 (Invitrogen, catalog number: V835-01)

20.ProteinFind^? Anti-V5 Mouse Monoclonal Antibody (TransGen Biotech, catalog number: HT401-01)

21.FITC-conjugated Rabbit anti-mouse IgG (BBI Life Sciences, catalog number: D110101)

22.氨芐青霉素ampicillin，Amp (BBI Life Sciences, catalog number: A610028)

23.D-(+)-葡萄糖 (BBI Life Sciences, catalog number: A610219)

24.D-(+)-半乳糖galactose，Gal (BBI Life Sciences, catalog number: A600215)

25.酪蛋白水解物casaminoacid (BBI Life Sciences, catalog number: A603060)

26.無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基yeast nitrogen base, without amino acids (上海生工公司, catalog number: A610507)

27.L-亮氨酸leucine，Leu (BBI Life Sciences, catalog number: A100811)

28.醋酸鋰粉末 (國(guó)藥, catalog number: 30109760)

29.Tris (上海生工公司, catalog number: A610195)

30.PEG2000 (BBI Life Sciences, catalog number: A601785)

31.EDTA (BBI Life Sciences, catalog number: A610185)

32.LB (Luria-Bertani) 液體培養(yǎng)基 (見溶液配方)

33.0.5 mol/L EDTA (見溶液配方)

34.50× TAE (tris base-acetic acid-EDTA) 母液 (見溶液配方)

35.1× PBS (phosphate-buffer-saline) 緩沖液 (pH 7.4) (見溶液配方)

36.1 mol/L LiAc (見溶液配方)

37.10 mg/mL Leu (見溶液配方)

38.10× TE (Tris-EDTA) Buffer (見溶液配方)

39.50% PEG2000 (見溶液配方)

40.TE/LiAc Buffer (見溶液配方)

41.40% PEG2000 (見溶液配方)

42.10× D (dextrose) (見溶液配方)

43.YNB (yeast nitrogen base, without amino acids) 缺陷培養(yǎng)基 (見溶液配方)

44.YNB-CAA (yeast nitrogen base-casamino acid) 培養(yǎng)基(見溶液配方)

45.YPD (yeast extract-peptone-dextrose) (見溶液配方)

46.10× Gal (galactose) (見溶液配方)

儀器設(shè)備

1.PCR儀 (Eppendorf, model: Mastercycler Pros)

2.核酸電泳儀 (北京市六一儀器廠, model: DYY-12)

3.凝膠成像儀 (Bio-Rad, Hercules, model: USAGel Doc^TM EZ)

4.空氣恒溫?fù)u床 (寧波科技園區(qū)新江南儀器有限公司, model: KYC-100B)

5.生化培養(yǎng)箱 (寧波東南儀器有限公司, model: LRH-50)

6.紫外分光光度計(jì) (上海美普達(dá)儀器有限公司, model: UV-3200)

7.離心機(jī) (Eppendorf, model: Centrifuge MiniSpin)

8.熒光顯微鏡 (Lecia, model: DFC450 C)

9.流式細(xì)胞儀 (BD, model: FACSVerse)

實(shí)驗(yàn)步驟

一、重組pYD1表達(dá)載體的構(gòu)建

1.PCR擴(kuò)增木聚糖基因orf6-un

以目標(biāo)基因?yàn)槟０?，分別用上游引物Primer-F：5' ACGATAAGGTACCAGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCC 3'和下游引物Primer-R：5' CCCTCTAGACTCGAGCGCCCCCTCGATATAGAC 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系 (表1)^[1]。

表1. PCR反應(yīng)體系

Table 1. PCR reaction mixture

10× PCR Buffer (with 15 mmol/L Mg²⁺)	5 μl
dNTP (10 mmol/L each)	1 μl
Primer-F (10 μmol/L)	2 μl
Primer-R (10 μmol/L)	2 μl
Template	5~10 ng
Pfu DNA polymerase (5 U/μl)	1 μl
加ddH₂O至	50 μl

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6× DNA上樣緩沖液以1:5的比例混合均勻，取混合液3 μl上樣于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。設(shè)置電壓為120 V，進(jìn)行約30 min電泳后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)，使用Image Lab v.5.2.1 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 觀察圖像并拍照（圖1）。使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，按照其說明書方法純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 PCR擴(kuò)增orf6-un基因

Fig. 1 PCR amplification of orf6-un gene

泳道1-2, orf6-un基因; M, Marker

2.雙酶切目的基因和載體

使用限制性內(nèi)切酶分別雙酶切載體和基因，酶切體系 (表2)，置于37 °C恒溫培養(yǎng)1-2 h，使用產(chǎn)物純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。

表2. 酶切體系

Table 2. Enzyme digestion reaction

基因/載體	1 μg
10× Buffer	5 μl
Enzyme I (10 U/μl)	1 μl
Enzyme II (10 U/μl)	1 μl
加ddH₂O至	50 μl

3.目標(biāo)基因與載體連接

利用同源重組的原理，通過Trelief^TM SoSoo Cloning Kit同源重組試劑盒將目的基因定向克隆到線性化載體pYD1中，反應(yīng)體系如表3所示。目標(biāo)基因與表達(dá)載體摩爾比約為5:1，50 °C反應(yīng)30 min。

表3. 同源重組體系

Table 3. Homologous recombination reaction

純化回收后的PCR產(chǎn)物(120ng/μl)	3 μl
線性化載體(80ng/μl)	1 μl
2× SoSoo Mix	5 μl
滅菌ddH₂O	1 μl
總計(jì)	10 μl

4.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

4.1將10 μl連接產(chǎn)物與50 μl大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞小心混勻后，冰浴10~15 min；

4.2將離心管置于42 °C水浴熱激60 s，立即取出冰浴2~3 min；

4.3向離心管中加入500 μl 37 °C預(yù)熱的滅菌LB液體培養(yǎng)基 (不含抗生素)，混勻后置于37 °C搖床150 rpm恒溫培養(yǎng)45 min，使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇；

4.4吸取100 μl已轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞，涂布于具有抗性篩選的LB固體培養(yǎng)基中。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板37 °C恒溫培養(yǎng)12~16 h；

4.5挑取菌斑進(jìn)行PCR鑒定，將篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子送公司測(cè)序。

二、釀酒酵母感受態(tài)制備

1.挑取釀酒酵母EBY100單菌落于5 ml含Amp的YPD液體培養(yǎng)基，30 °C，200 rpm培養(yǎng)過夜；

2.取新鮮種子液100 μl接種于含10 ml YPD液體培養(yǎng)基的搖瓶中，30 °C，200 rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.4~0.6；

3.4 °C，3,000 rpm，離心5 min，回收菌體；

4.倒去上清液，用2 ml滅菌ddH₂O反復(fù)洗滌兩次，4 °C，3,000 rpm，離心5 min；

5.倒去上清液，用1 ml的TE/LiAc buffer重懸沉淀；

6.倒去上清液，用200 μl的TE/LiAc buffer重懸沉淀，每管分裝50 μl，即為酵母感受態(tài)。

三、LiAc轉(zhuǎn)化法

1.向50 μl酵母感受態(tài)細(xì)胞中加入5 μl重組質(zhì)粒 (1~1.5 μg)混合均勻，30 °C保溫30 min，每間隔10 min混勻一次；

2.每管加入1 ml 40% PEG2000，重懸沉淀，30 °C保溫1 h；

3.42 °C水浴中熱激15 min；

4.4 °C，12,000 rpm，離心1 min，去上清；

5.每管加入1 ml YPD液體培養(yǎng)基，30 °C保溫2 h；

6.取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物100 μl涂布于含亮氨酸的YNB固體缺陷培養(yǎng)基上，待液體被吸收將平板倒置，30 °C培養(yǎng)2~3 d。

四、支架蛋白的表面展示

1.支架蛋白的表達(dá)

挑取單菌落于5 ml YNB-CAA液體培養(yǎng)基，30 °C培養(yǎng)12~24 h。按5%的接種量將新鮮種子液接種于50 ml YNB-CAA液體培養(yǎng)基中，30 °C恒溫培養(yǎng)12~24 h至OD₆₀₀為1~1.5。3,500 rpm，4 °C離心5 min收集菌體，使用滅菌ddH₂O清洗兩次。加入75 ml YNB-CAA液體培養(yǎng)基重懸菌體，并加入終濃度為2%的半乳糖，25 °C誘導(dǎo)48 h后，取上清液和菌體用于后續(xù)分析。

2.免疫熒光分析

將誘導(dǎo)后新鮮的酵母細(xì)胞（EBY100/orf6-un）稀釋至OD₆₀₀= 0.5，設(shè)置EBY100為陰性對(duì)照。取酵母細(xì)胞體積500 μl加入V₅標(biāo)記的鼠抗1 μl，16 °C雜交1 h，1× PBS緩沖液反復(fù)清洗5次。加入500 μl的1×PBS緩沖液重懸沉淀，加入2.5 μl FITC標(biāo)記的IgG兔抗鼠，16 °C避光雜交1 h，1× PBS緩沖液反復(fù)清洗5次后。1 ml 1× PBS緩沖液重懸沉淀，置于熒光顯微鏡下觀察拍照（圖2）。

圖2 免疫熒光分析木聚糖酶ORF6-UN表面展示

Fig. 2 Immunofluorescence microscopy analysis of surface-displayed xylanase ORF6-UN

A, C: 表面展示細(xì)胞EBY100/orf6-un; B, D:陰性對(duì)照 EBY100

3.流式細(xì)胞術(shù)分析

參照免疫熒光抗體雜交的方法進(jìn)行抗體雜交，細(xì)胞終濃度控制在~10⁶cell/ml。取300 μl稀釋好的帶有FITC抗體的酵母細(xì)胞于流式上樣管中，在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm及發(fā)射波長(zhǎng)535 nm的條件下，分析熒光細(xì)胞的比例。同時(shí)設(shè)置EBY100為陰性對(duì)照^[2]。

溶液配方

1.LB液體培養(yǎng)基

稱取酵母提取物 (yeast extract) 2.5 g

胰蛋白胨 (tryptone) 5.0 g

NaCl 5.0 g

加500 ml ddH₂O溶解，121 °C，20 min

加入2.0%的瓊脂粉即為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基

2.0.5 mol/L EDTA (ethylene diaminete traacetic acid)

稱取1.861 g EDTA·2H₂O加入8.0 ml ddH₂O，用NaOH調(diào)pH至8.0，ddH₂O定容至10 ml

3.50× TAE (tris base-acetic acid-EDTA) 母液

稱取Tris 242.0 g

冰醋酸57.1 ml

0.05 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 ml

加ddH₂O至1,000 ml，將其稀釋至1×為工作液

4.1× PBS緩沖液 (pH 7.4)

稱取NaCl 8.0 g

KCl 0.2 g

Na₂HPO₄ 1.42 g

KH₂PO₄ 0.27 g

加800 ml ddH₂O溶解，調(diào)pH至7.4，定容至1,000 ml

5.1 mol/L LiAc

稱取10.2 g醋酸鋰粉末，溶于80 ml ddH₂O，定容至100 ml，121 °C，20 min，4 °C保存

6.10 mg/mL Leu

稱取1.0 g亮氨酸粉末，溶于10 ml滅菌ddH₂O中，0.22 μm無菌濾膜過濾，分裝至1.5 ml離心管，-20 °C保存

7.10× TE Buffer

100 ml 1 mol/L的Tris-HCl (pH 8.0)，200 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)，加ddH₂O定容至100 ml，121 °C，20 min，4 °C保存

8.50% PEG2000

稱取50 g PEG2000粉末，溶于80 ml ddH₂O，待粉末徹底溶解，定容至100 ml，121 °C，20 min，4 °C保存

9.TE/LiAc Buffer

1 ml 10× TE Buffer，1 ml 1 mol/L LiAc，加ddH₂O定容至10 ml，4 °C保存

10.40% PEG2000

10×TE Buffer和1 mol/L LiAc各1 ml與8 ml 50%的PEG2000混合均勻，4 °C保存

11.10× D

稱取20.0 g D-葡萄糖，加ddH₂O溶解并定容至100 ml，121 °C，20 min，室溫放置

12.YNB缺陷培養(yǎng)基

稱取0.67 g YNB溶于90 ml ddH₂O，121 °C，20 min

加10 ml 10× D，1 ml 10 mg/ml Leu，4 °C保存

在液體培養(yǎng)基中加入2.0%瓊脂即為YNB固體缺陷培養(yǎng)基

13.YNB-CAA培養(yǎng)基

稱取0.67 g YNB和0.5 g CAA，加ddH₂O至90 ml，121 °C，20 min，4 °C保存

14.YPD (yeast extract peptone dextrose)

稱取酵母膏0.5 g，蛋白胨1 g，加ddH₂O至45 ml，121 °C，20 min

加5 ml滅菌的10× D，4 °C保存

15.10× Gal

稱取20.0 g D-半乳糖溶于100 ml ddH₂O，121 °C，20 min，室溫保存

致謝

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)子課題“農(nóng)副產(chǎn)品利用與飼料資源開發(fā)技術(shù)集成與應(yīng)用” (2018YFD0501903)

參考文獻(xiàn)

1. Wang, J. K. He, B. Du, W. et al. (2015). Yeast with surface displayed xylanase as a new dual purpose delivery vehicle of xylanase and yeast. Anim Feed Sci Technol, 208: 44-52.