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患者來源的NLC和M2-THP 1細胞產(chǎn)生EV，其快速摻入CLL-B細胞中當培養(yǎng)8天后凋亡細胞的百分比達到約68%時，當CLL-B細胞在乳樣細胞（NLC）存在下共培養(yǎng)時，其降低至約16%，當CLL-B細胞在M2-THP 1細胞存在下共培養(yǎng)時，其降低至約28%。如前所述，這些數(shù)據(jù)表明NLC和M2-THP 1細胞均促進白血病B細胞的存活[4，32]。在本研究中，作者假設并提供證據(jù)表明，NLC和M2-THP 1都能夠通過EV向白血病細胞發(fā)送生存信號。為了研究，作者首先驗證了EV在NLC和M2-THP 1細胞的培養(yǎng)上清液中的存在。通過超離心分離EV，并通過納米顆粒跟蹤分析（NTA）分析其尺寸分布。對于兩種類型的EV的大小，獲得了103 ± 10 nm的模式（圖1A，B），這表明分離的囊泡主要在外來體的大小范圍內(nèi)[33]。還通過針對⑶ 9、⑶ 63和⑶ 81的免疫印跡分析EV。這三種外泌體標記物[34]存在于來自囊泡的蛋白質(zhì)提取物中，進一步證實了這些EV在外泌體中富集的可能性（圖1C）。EV還表達巨噬細胞標志物CD 68，從而證實了它們的來源（圖1C）。接下來，為了檢查EV穿透CLL-B細胞的能力，將它們與從NLC或M2-THP 1細胞獲得的PKH 67綠色標記的EV一起孵育30分鐘、2小時、12小時或24小時，并通過流式細胞術分析綠色熒光（圖1D）。EV的攝取是一個快速的過程，超過87%的CLL-B細胞在30分鐘后具有整合的熒光EV。EV的整合也通過在孵育24小時后CLL-B細胞的共聚焦顯微鏡成像來證實（圖1 E）。來自NLC和M2-THP 1的EV保護CLL-B細胞免于離體自發(fā)凋亡將來自NLC和M2-THP 1細胞的EV添加至CLL-B細胞導致CLL-B細胞的自發(fā)凋亡減少。隨著EV的加入，CLL-B細胞在48小時內(nèi)經(jīng)歷凋亡的速率顯著降低。令人驚訝的是，對于所有測試的EV量（10-100 ng EV蛋白），細胞凋亡水平的降低是相等的。EV的添加還影響CLL-B細胞的離體增殖。在添加EV后，增殖速率（在48小時的時間段內(nèi)計算）顯著增加，在25 ng時達到平臺。該數(shù)據(jù)強調(diào)了EV的強抗凋亡作用，即使在相對低的劑量下，以及它們的增殖作用。對于其余的實驗，作者選擇用25 ng EV蛋白/25000個細胞（對應于1.10- 3 ng/細胞的濃度）處理CLL-B細胞，因為這是作者測試的對細胞凋亡和增殖具有最高顯著效果的最低濃度。使用IncucyteS 3裝置進行的分析使作者能夠在48小時內(nèi)監(jiān)測細胞凋亡和增殖水平。作為對照，分離來自健康供體的單核細胞/巨噬細胞（NLC僅與CLL相關）的EV，以評估NLC的健康對應物的影響，并消除所觀察到的效應可能由EV內(nèi)化引起的可能性，無論其來源如何。如預期的，從健康單核細胞/巨噬細胞分離的EV對CLL-B細胞凋亡和增殖沒有顯著影響。然而，添加來自M2-THP 1和NLC的EV（25 ng蛋白/25，000個細胞）導致細胞凋亡顯著減少（圖2A），而CLL-B細胞增殖在相同條件下增加（圖2B）。由于對細胞凋亡的抗性是CLL-B克隆淋巴細胞的標志，其特征在于抗細胞凋亡BCL-2家族蛋白的表達升高[34]，作者測量了與來自M2-THP 1細胞或NLC的EV孵育的CLL-B細胞中編碼抗細胞凋亡蛋白的BCL-2和MCL-1基因的表達水平（圖2C，D）。MCL-1基因表達保持不受EV影響（圖2D），而BCL-2在與EV孵育的CLL-B細胞中顯著過表達（圖2C）。此外，APRIL（一種增殖誘導配體）先前已被描述為在CLL-B細胞中過表達[35]。因此，作者評估了與來自M2-THP 1細胞或NLC的EV一起孵育的CLL-B細胞中該生長因子的表達水平（圖2 E），并觀察到EV誘導CLL-B細胞中APRIL的過表達。作者先前觀察到，當與來自NLC和M2-THP 1細胞的EV一起孵育時，CLL-B細胞表現(xiàn)出增強的存活，這一過程已經(jīng)被描述為依賴于BCL-2的過表達[6]。為了更深入地了解由這些EV觸發(fā)的抗凋亡途徑，作者使用蛋白質(zhì)陣列方法對凋亡途徑活化進行了全面分析。作者采用的陣列使作者能夠量化與凋亡相關的43種蛋白質(zhì)的相對水平。未處理的CLL-B細胞和與來自患者來源的NLC的EV一起孵育的CLL-B細胞之間的比較分析揭示了EV處理后IGFBP-2和CD 40蛋白水平的顯著增加。BCL-2和p53蛋白的量也增加，其在CLL中的參與已經(jīng)被充分記錄[35，36]，但并不顯著。為了更好地確認蛋白質(zhì)水平的這些變化，作者分析了來自用或不用NLC EV治療的三個不同患者的CLL-B細胞（圖3）。結(jié)果證實，在與NLC EV一起孵育的CLL-B細胞中，蛋白IGFBP-2、CD 40、p53以及BCL-2的水平顯著增加。當與NLC EV孵育時，在CLL-B細胞中觀察到的抗凋亡蛋白水平升高促使作者探索與未處理的細胞相比，經(jīng)處理的B細胞中的轉(zhuǎn)錄組改變。為了實現(xiàn)這一點，作者對從五名不同的CLL患者中獲得的B細胞進行了RNAseq分析，這些患者用NLC EV治療或不治療。不幸的是，由于測序過程中的問題，五名患者中有兩名的分析是不確定的（與其他樣品相比，讀數(shù)顯著較少，超過30%的讀數(shù)僅映射一次），因此作者選擇僅分析三名患者（患者#10，12和13）的數(shù)據(jù)。由于隊列規(guī)模小和個體間變異性高（圖4A），作者使用配對分析方法分析了結(jié)果。有趣的是，77%的DEG是蛋白質(zhì)編碼基因，15%是lncRNA。在上調(diào)的基因中，作者特別發(fā)現(xiàn)了：RGS1（G蛋白信號調(diào)節(jié)因子1）和DAD 1（細胞死亡防御因子1），如圖4D所示。RNASeq結(jié)果還揭示了各種下調(diào)的基因（圖4 B）。其中，作者發(fā)現(xiàn)了SPEN（spen family transcriptional repressor）、AHNAK（AHNAK nucleoprotein）和AMER 1（APC membrane recruitment protein 1）。(Fig.4D）。總體而言，這些結(jié)果表明，來自患者源性NLC的EV能夠誘導CLL-B細胞中的基因表達修飾，這可以通過激活或抑制參與腫瘤發(fā)生的多種信號傳導途徑來促進CLL進展。然而，重要的是要注意，由于研究中納入的個體數(shù)量較少，個體間變異性較高，這些結(jié)果仍是初步的。雖然它們?yōu)镹LC EV改變基因表達以將攻擊性轉(zhuǎn)移到CLL-B細胞的潛力提供了有價值的見解，但仍需要進一步的實驗工作來證實和加深作者對觀察到的變化的理解。M2-THP 1 EV含有參與各種致癌途徑的蛋白質(zhì)為了鑒定哪些蛋白質(zhì)作用物可能負責將攻擊性轉(zhuǎn)移到CLL-B細胞，作者使用質(zhì)譜法對EV進行了全蛋白質(zhì)組分析。由于技術困難（從作者的NLC培養(yǎng)物中獲得足夠量的EV蛋白提取物），作者無法對來自NLC的EV進行這種分析，因此作者使用來自M2-THP 1細胞的EV，因為它們更容易獲得足夠用于隨后質(zhì)譜分析的量。蛋白質(zhì)組學分析在3次重復中鑒定了超過1000種蛋白質(zhì)，其中608種蛋白質(zhì)是所有樣品共有的。M2-THP 1 EV的全蛋白質(zhì)組分析確定了與血液惡性腫瘤相關的幾種途徑，在某些情況下，特別是與慢性淋巴細胞白血病相關。在圖5A中，作者針對數(shù)據(jù)庫ExoCarta的人蛋白質(zhì)組庫生成了M2-THP 1 EV中通過質(zhì)譜法在每個重復中鑒定的蛋白質(zhì)的維恩圖[37]。這表明作者鑒定的93.6%的蛋白質(zhì)在ExoCarta數(shù)據(jù)庫中，并且外泌體中最常見的蛋白質(zhì)（ExoCarta top 100）中有71%存在于樣品中，進一步證實了樣品中實際上存在外泌體。為了深入了解鑒定的蛋白質(zhì)的功能，創(chuàng)建了REACTOME富集點圖（圖5 B）。它有助于在作者的研究背景下識別幾種感興趣的途徑，所有這些途徑都表現(xiàn)出顯著的p值。在鑒定的途徑中，作者毫不意外地發(fā)現(xiàn)了與免疫系統(tǒng)、T細胞受體（TCR）信號傳導、白細胞介素信號傳導和BCR信號傳導相關的途徑。免疫系統(tǒng)的失調(diào)是血液惡性腫瘤發(fā)展的關鍵因素，因為它可導致對自身抗原的耐受性喪失和惡性細胞的積累[38]。這些結(jié)果與先前的工作一致，其證明與健康對照相比，參與這些相同途徑的蛋白質(zhì)在來自鼠CLL模型的TME的EV中過表達[12]。同時，BCR信號在B細胞的存活和增殖中起著至關重要的作用，其信號失調(diào)與CLL和許多其他B細胞惡性腫瘤的發(fā)病機制有關。根據(jù)本研究中獲得的結(jié)果，鑒定了許多參與細胞凋亡調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。此外，作者發(fā)現(xiàn)參與轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB和RUNX 3）活化的作用因子，這兩種因子均與血液惡性腫瘤的發(fā)生有關[39，40]。p53通路是一條重要的腫瘤抑制通路，它可以阻止未修復的DNA損傷的積累。在CLL中，p53改變與不良臨床結(jié)局和治療失敗相關[41，42]。總之，在M2-THP 1細胞產(chǎn)生的EV的蛋白質(zhì)組學分析中鑒定的途徑涉及血液惡性腫瘤的各個方面，包括免疫調(diào)節(jié)、細胞存活和細胞死亡。這些途徑與CLL和其他血液惡性腫瘤的發(fā)展和進展有關，突出了EV在這些疾病發(fā)病機制中的潛在重要性。來自NLC細胞的EV增加CLL-B細胞對伊魯替尼的耐藥性如前所述，EV誘導對細胞凋亡的抗性，但作者想知道它們是否與CLL-B細胞的耐藥性有關，特別是對伊魯替尼的耐藥性。將來自8名不同患者的CLL-B細胞用單獨的伊魯替尼、伊魯替尼與來自健康單核細胞/巨噬細胞的EV的組合、伊魯替尼與來自患者來源的NLC的EV的組合或伊魯替尼與來自M2-THP 1細胞的EV的組合處理。處理后，未觀察到健康單核細胞/巨噬細胞的影響。與用它們的健康對應物處理的那些相比，用依魯替尼和NLC EV處理的CLL-B細胞顯示出顯著更低（P= 0.0344）的凋亡水平，凋亡水平降低1.4倍（圖6A）。至于M2-THP 2 EV，盡管不顯著，但與用伊曲替尼和健康單核細胞衍生的EV治療的病癥相比，細胞凋亡也略有減少。關于增殖，雖然沒有統(tǒng)計學顯著性，但結(jié)果傾向于顯示與用伊克替尼和健康單核細胞/巨噬細胞處理的細胞相比，用伊克替尼和NLC EV處理的細胞以及用伊克替尼和M2-THP 1 EV處理的細胞增加。總的來說，這些結(jié)果表明，源自NLC的EV能夠在體外誘導白血病B細胞患者中的伊克替尼耐藥性。 總結(jié) 這些結(jié)果表明，來自微環(huán)境的EV，而不僅僅是來自惡性B細胞的EV，能夠調(diào)節(jié)其受體的細胞活性，發(fā)送致癌信號以促進白血病細胞的侵襲性。NLC以前曾被確定為TME的關鍵參與者，但以前從未顯示過它們通過EV傳遞信息。這項工作強調(diào)了NLC作為治療靶點的潛力以及EV作為這種病理學中生物標志物的相關性。最后，作者想指出，體外產(chǎn)生純化的NLC可能具有挑戰(zhàn)性，并且根據(jù)定義，NLC依賴于相鄰B CLL細胞的存在。將它們留在沒有B CLL的培養(yǎng)基中48小時以取回它們的EV可能會影響細胞，因此使它們或多或少地不同于它們的體內(nèi)對應物。
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