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從患者樣本中提取的細胞外囊泡(EV)的分離和隨后的分子分析是了解囊泡生物學(xué)和促進生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的一種廣泛使用的策略。尿液中表達的前列腺分泌物是一種腫瘤近端液體，作為用于液體活檢方案的潛在前列腺癌(PCa)生物標(biāo)志物的來源，已受到廣泛關(guān)注。標(biāo)準EV分離方法，如差速超速離心(dUC)共同分離蛋白質(zhì)污染物，這些污染物在典型的質(zhì)譜(MS)協(xié)議中掩蓋了低豐度蛋白質(zhì)。使表達的前列腺分泌物的分析更加復(fù)雜的是，尿調(diào)節(jié)素，也稱為Tamm-Horsfall蛋白(THP)，在尿液中以高濃度存在。THP可以形成聚合物，在純化過程中捕獲EV，從而降低產(chǎn)量。用二硫蘇糖醇(DTT)破壞THP聚合物網(wǎng)絡(luò)可以釋放被困的EV，但在隨后的超速離心過程中，較小的THP纖維會與EV共同分離。為了解決這些挑戰(zhàn)，來自東弗吉尼亞醫(yī)學(xué)院的Lifang
Yang研究團隊在JEV雜志發(fā)表文章，報道了一種dUC方法，該方法結(jié)合了THP聚合物還原和堿性洗滌，以去除THP和其他常見的蛋白質(zhì)污染物、改善EV分離效果。 
前列腺癌(PCa)是最常見的癌癥。它表現(xiàn)出高度異質(zhì)的臨床表現(xiàn)，新診斷的病例從適合主動監(jiān)測的固有惰性疾病到未經(jīng)治療會致命的侵襲性惡性腫瘤。因此，迫切需要開發(fā)生物標(biāo)志物以準確量化新診斷或未治療腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力。理想的生物標(biāo)志物可以通過“液體活檢”技術(shù)檢測，該技術(shù)有助于對疾病狀態(tài)進行微創(chuàng)或無創(chuàng)監(jiān)測，以支持對患有高度惰性疾病的男性進行安全主動監(jiān)測。監(jiān)測前列腺特異性抗原(PSA)濃度被廣泛用于此目的，但單獨使用或與其他分子生物標(biāo)志物聯(lián)合使用時對PCa的特異性和敏感性不足。尿液中表達的前列腺分泌物（EPS-urine）為填補這一空白提供了一條有希望的途徑。EPS-urine可以通過在臨床標(biāo)準直腸指檢(DRE)后收集尿液來獲得。這種液體富含前列腺衍生的蛋白質(zhì)，是前列腺特異性生物標(biāo)志物的現(xiàn)成來源。EPS-urine也富含來自前列腺和泌尿道的細胞外囊泡(EV)。這些小的膜封閉囊泡包括“外泌體”（~40-150nm），它們通過內(nèi)體衍生的多泡體和其他類似大小的EV的表面融合釋放，具體取決于所采用的分離技術(shù)。由于EV生物發(fā)生的機制，EV的分子成分受到母細胞分子成分的嚴重影響。重要的是，EV通過將包括核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物活性貨物分子轉(zhuǎn)移到局部或遠端部位的靶細胞來介導(dǎo)細胞內(nèi)通訊。腫瘤衍生的EV通過與腫瘤微環(huán)境相互作用在腫瘤發(fā)生和進展中發(fā)揮作用。此外，雙層膜的存在保護封閉的貨物分子免受外源性核酸酶、蛋白酶和其他降解酶的影響，確保EV在包括尿液在內(nèi)的不同體液中具有高穩(wěn)定性。在最近的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，已在這些囊泡中鑒定出數(shù)千種蛋白質(zhì)。因此，來自PCa患者EPS-urine的尿細胞外囊泡(uEV)的蛋白質(zhì)分析有望開發(fā)非侵入性PCa生物標(biāo)志物，以幫助臨床管理該疾病。雖然是蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的理想來源，但從尿液中分離EV存在著巨大的挑戰(zhàn)。尿液具有較寬的離子濃度和pH范圍、蛋白質(zhì)豐度的動態(tài)幅度以及個體內(nèi)部和個體間的高變異性。此外，大量尿調(diào)節(jié)素（也稱為Tamm-Horsfall蛋白(THP)）的存在對uEV分離提出了獨特的問題。THP通常是尿液中最豐富的蛋白質(zhì)，每天分泌30-60毫克。它合成為GPI連接的膜糖蛋白，在細胞外蛋白水解切割后分泌到尿液中。分泌的THP單體聚集形成高分子量繩狀細絲或電子顯微鏡可見的基質(zhì)。這些THP矩陣可以捕獲EV，使其無法進行分析，從而降低產(chǎn)量。其次，與其他污染性可溶性蛋白質(zhì)一樣，THP單體/寡聚體可以同時與EV一起沉淀和/或與EV結(jié)合，從而降低最終的uEV純度。這兩個因素共同影響了uEV的回收率，并降低了質(zhì)譜(MS)分析對低豐度uEV蛋白的檢測深度。已經(jīng)采用了幾種策略來最小化THP對uEV產(chǎn)率和純度的影響。差速超速離心(dUC)是分離EV最廣泛使用的方法。傳統(tǒng)的dUC采用連續(xù)離心步驟，其中早期的“低速”（17,000-20,000g）離心去除較大的THP基質(zhì)。然而，一部分uEV群體與THP矩陣共同分離，從而降低了回收率并引入了偏差。用還原劑二硫蘇糖醇(DTT)處理低速顆粒會使THP解聚并能夠回收被困EV。不幸的是，在解聚過程中產(chǎn)生的較小的THP纖維是隨后的“高速”（100,000-200,000g）離心步驟中潛在污染和與EV共沉淀的重要來源。該研究描述了一種改進的dUC方法，該方法采用堿洗來有效回收THP包埋的uEV，同時減少污染蛋白質(zhì)。與現(xiàn)有的dUC方法相比，該方法顯著提高了uEV的產(chǎn)率和純度。作為新方法的生物學(xué)挑戰(zhàn)，作者將該方法應(yīng)用于來自PCa患者的EPS尿液樣本，并使用MS描述了與PCa相關(guān)的uEVs蛋白質(zhì)組。 差異超速離心(dUC)富集的EPS-尿細胞外囊泡的表征該方法應(yīng)用于尿液中人類表達的前列腺分泌物時，該方法實現(xiàn)了已知前列腺和前列腺癌相關(guān)EV駐留蛋白的相對富集。該方法為尿液EV的總蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了一種有前景的策略。 與uEV相關(guān)的高豐度尿蛋白、假定污染物和選定的ECM蛋白的相對去除 uEV中推定的EV標(biāo)記蛋白和膜蛋白類別的相對富集 體內(nèi)前列腺特異性和前列腺癌相關(guān)蛋白的相對富集Correll
VL, Otto JJ, Risi CM, Main BP, Boutros PC, Kislinger T, Galkin VE, Nyalwidhe
JO, Semmes OJ, Yang L. Optimization of small extracellular vesicle isolation
from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. J
Extracell Vesicles. 2022 Feb;11(2):e12184. doi: 10.1002/jev2.12184. PMID:
35119778.
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