DNA穩(wěn)定同位素示蹤與宏基因組單菌草圖組裝聯(lián)用技術(shù)

DNA-Stable Isotope Probing and Metagenomics Binning

徐銳^{1, 2}，陶婉^{1, 2}，黃端儀^{1, 2}，蘇平舟^{1, 2}，孫曉旭^{1, 2}，張苗苗^{1, 2}，孫蔚旻^{1, 2, *}

¹華南土壤污染控制與修復(fù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東省科學(xué)院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，廣州市，廣東省；²廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市，廣東省

^*通訊作者郵箱: wmsun@soil.gd.cn

引用格式：徐銳, 陶婉, 黃端儀, 蘇平舟, 孫曉旭, 張苗苗, 孫蔚旻. (2021). DNA穩(wěn)定同位素示蹤與宏基因組單菌草圖組裝聯(lián)用技術(shù). // 微生物組實(shí)驗(yàn)手冊. Bio-101: e2003705. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003705.

How to cite: Yunyun Gao, Kai Peng, Defeng Bai, et al. 2024. The Microbiome Protocols eBook initiative: Building a bridge to microbiome research. iMeta 3: e182. https:///10.1002/imt2.182

摘要：高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展極大地促進(jìn)了環(huán)境功能微生物基因組學(xué)的研究，但傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)技術(shù)以樣品的所有序列為研究對象，原始測序數(shù)據(jù)量龐雜 (Gb級別) ，存在較多的噪音干擾，易導(dǎo)致微生物信息挖掘效率低下。本文介紹了DNA穩(wěn)定同位素示蹤與宏基因組單菌草圖組裝聯(lián)用技術(shù)，可將目標(biāo)功能微生物的基因組進(jìn)行有效標(biāo)記和分離，從而簡化了宏基因組分析難度。具體包括：首先通過含¹³C穩(wěn)定同位素的標(biāo)記物作為唯一碳源與微生物共培養(yǎng) (DNA-SIP)，可直接錨定參與代謝過程的功能菌群 (Neufeld et al., 2007)，極大地降低了后續(xù)測序數(shù)據(jù)的噪音干擾，提高生物信息挖掘效率。然后對錨定的DNA進(jìn)行高深度的宏基因組測序，再基于無參比對方法將短序列分箱 (Metagenomic Binning)，重構(gòu)微生物在株水平的基因組草圖(Alneberg et al., 2014; Sun et al., 2018)。通過對非培養(yǎng)模式獲得的功能微生物，進(jìn)行基因注釋和代謝通路分析，解析環(huán)境功能微生物的進(jìn)化和代謝特性，可有效發(fā)掘新型/未知功能物種的基因組學(xué)信息 (Quince et al., 2017; Zhang et al., 2020)。

關(guān)鍵詞：穩(wěn)定同位素示蹤，高通量測序，宏基因組分箱，基因組DNA，環(huán)境功能微生物

基本原理

1.穩(wěn)定同位素示蹤原理

在碳同化培養(yǎng)體系中添加含¹³C的標(biāo)記物與微生物共培養(yǎng)。該過程中微生物如果可以利用標(biāo)記物進(jìn)行同化作用，則可將¹³C合并至自身DNA，從而完成對目標(biāo)功能菌群的“標(biāo)記”。然后收集樣品總DNA，利用超速離心機(jī)分離，¹³C-DNA主要分布在底層（重層），未被標(biāo)記的¹²C-DNA則主要分布在上層（輕層）。重點(diǎn)收集重層DNA行下游的高通量測序及生物信息學(xué)分析。

2.宏基因組分箱原理

宏基因組分箱（Binning）基于宏基因組原始測序序列，可進(jìn)一步將其中混合了不同微生物的序列或序列組裝得到的contigs按物種進(jìn)行分類。提取個(gè)體基因組草圖(bins)可以實(shí)現(xiàn)宏基因組的單菌基因組水平分析。以往傳統(tǒng)的單物種全基因組序列都是對目標(biāo)菌群經(jīng)過純培養(yǎng)后，方能進(jìn)行全基因組de novo測序。但是環(huán)境中存在著大量的不可培養(yǎng)微生物，Binning技術(shù)不依賴培養(yǎng)條件就可獲得微生物的全基因組序列，從而獲得新物種的基因組序列和代謝功能等生物信息。

Figure from: MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis

材料與試劑

1.普通¹²C乙酸 (北京百靈威科技有限公司，Lot: LE10Q200)

2.¹³C乙酸 (Cambridge Isotope Laboratories,Inc，Lot: PR-29445)

3.DNA提取試劑盒(QIAGEN GmbH，Lot: 163046382)

4.qPCR試劑盒 (Takara，Lot: AJ91708A)

5.氯化銨 (廣州化學(xué)試劑廠)

6.十二水合·磷酸氫二鈉 (麥克林，Lot: C11160473)

7.磷酸二氫鉀 (廣州化學(xué)試劑廠)

8.氯化鎂 (廣東光華科技有限公司，Lot: 20190404)

9.刃天青 (北京百靈威科技有限公司)

10.TE buffer (ZOMANBIO，Lot: 9BB08S)

11.氯化銫 (BIOBOMEI，Lot: B23V1019)

12.無水乙醇 (阿拉丁)

13.核酸助沉劑 (ZOMANBIO)

儀器設(shè)備

1.掌上離心機(jī) (Scilogex)

2.專用離心管 (Eppendorf Centrifuge 5430 R)

3.超高速離心機(jī) (Beckman Optima MAX-TL)

4.Qubit定量 (Thermo Fisher Scientific)

5.qPCR儀 (BIO-RAD CFX96 Real-Time System)

6.DNA裂解儀 (MP Biomedicals FASTPREP-24)

7.SIP分層泵 (Beckman)

8.真空濃縮儀 (Eppendorf)

9.振蕩器 (Silentshake)

10.折光率儀 (Atago)

軟件和數(shù)據(jù)庫

1.QIIME2 (擴(kuò)增子分析主流軟件)

系列教程：https://docs./2020.11/

2.Megahit組裝軟件

安裝：conda install -y megahit

使用：time megahit -t 30 \

  -1 `ls 質(zhì)控后序列路徑/File_1.fq|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \

  -2 `ls 質(zhì)控后序列路徑/File _2.fq|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \

  -o YOUR PATH/megahit  --k-min 21 --k-max 121 --k-step 10

官方文檔：《MEGAHIT: an ultra-fast single-node solution for large and complex metagenomics assembly via succinct de Bruijn graph》Bioinformatics, 2015.

3.MetaWRAP宏基因組分箱軟件

安裝：conda install -c ursky metawrap -mg

使用：metawrap binning -o results/01_binning -t 30 -a YOUR PATH TO/final.contigs.fa \

  --metabat2 --maxbin2 --concoct YOUR PATH TO指控后序列/File_clean_*.fastq

官方文檔：《MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis》Microbiome, 2018.

4.Kneaddata質(zhì)控軟件

安裝：conda install -y kneaddata

使用：time kneaddata -i seq/sample_1.raw.fq.gz -i seq/ sample _2.raw.fq.gz \

-o temp/qc -v -t 30 --remove-intermediate-output \

--trimmomatic ~/miniconda2/envs/metagenome_env/share/trimmomatic/

--trimmomatic-options 'SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:70' \

--bowtie2-options "--very-sensitive --dovetail" -db YOUR PATH TO/db/bowtie2'

5.Prokka 細(xì)菌基因組注釋

安裝：conda install -y prokka

使用：time prokka YOUR PATH TO/megahit/final.contigs.fa --outdir temp/prokka \

  --prefix mg --metagenome --kingdom Archaea,Bacteria,Mitochondria,Viruses \

  --force --cpus 30

官方文檔：《Prokka: rapid prokaryotic genome annotation》Bioinformatics, 2015.

6.Salmon基因定量工具

安裝：conda install -y salmon

使用：time parallel -j 3 \

  'salmon quant -i temp/salmon/index -l A -p 40 --meta \

  -1 YOUR PATH TO指控后序列/File_clean_1.fastq \

  -2 YOUR PATH TO指控后序列/File_clean_1.fastq \

  -o temp/salmon/Sample_output.quant'

官方文檔：《Salmon: fast and bias-aware quantification of transcript expression using dual-phase inference》Nature Methods, 2017.

說明

1.本文以最簡單的乙酸降解功能菌分析流程進(jìn)行介紹，讀者可根據(jù)實(shí)際需要將標(biāo)記物由¹³C乙酸替換成其他標(biāo)記物，如¹³C乳酸、¹³C碳酸氫鈉、¹³C甲苯等。

2.¹³C標(biāo)記物建議直接購買商用產(chǎn)品。

3.本文描述的¹²C標(biāo)記物即為普通試劑。

4.以下實(shí)驗(yàn)操作中所用的槍頭、離心管、西林瓶等耗材均需經(jīng)過高壓滅菌處理。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、建立共培養(yǎng)微宇宙 (以乙酸降解菌群為例)

1.共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組如表1所示：

表1.實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

2.配制1 L礦物鹽溶液 (MSM，配方見表2)，利用高壓滅菌鍋將MSM、曝氣所需針頭、西林瓶、膠塞滅菌，然后冷卻備用；MSM當(dāng)天配當(dāng)天使用；

3.稱量2 g 土壤于已滅菌的西林瓶中，再加入100 ml 的MSM和100 ul的1 g/l的刃天青使用液；

4.用氮?dú)馄貧饷撗?0 min后用膠塞塞緊，再用匹配的鋁蓋膠塞密封；

5.根據(jù)不同分組，利用注射器分別添加¹³C-乙酸或¹²C-乙酸至西林瓶內(nèi)，充分搖勻；

6.微宇宙放入恒溫?fù)u床，在30 °C下進(jìn)行共培養(yǎng)，用于標(biāo)記乙酸降解菌群；

7.參與乙酸降解的菌群，可將¹³C合并至自身DNA，從而完成標(biāo)記。

二、提取DNA

1.待反應(yīng)結(jié)束后，破開微宇宙，靜置沉淀一段時(shí)間后倒掉部分上清液，將剩余泥水混合物小心轉(zhuǎn)移至50 ml離心管后離心15min (7500 x g)；

2.倒掉上清液，僅保留濕土用于DNA的提?。?/span>

3.建議使用DNA提取試劑盒提取樣品的基因組DNA；

4.利用Qubit測定所提取的DNA濃度。

三、超速離心分層

1.經(jīng)¹³C標(biāo)記后的DNA密度相對于未標(biāo)記的DNA更大，可由超速離心機(jī)進(jìn)行分離；

2.用TE buffer和氯化銫粉末制備CsCl預(yù)配液 (折光率RI = 1.4032)和CsCl平衡溶液 (RI = 1.4020 ± 0.0001)；

注：每個(gè)樣品需要大約5 ml的CsCl預(yù)配液，根據(jù)所需樣品配制足量的溶液，如離心6個(gè)樣品，制備40 ml即可；CsCl平衡溶液所需體積較少，制備5 ml左右即可。

3.添加CsCl預(yù)配液至SIP專用離心管刻線處，示意圖如下：

圖1. CsCl預(yù)配液添加量示意圖

4.根據(jù)提取的DNA濃度，取總量3000 ng的DNA至SIP專用離心管中；

5.離心管簡單密封后渦旋震蕩20 s，混勻CsCl預(yù)配液與DNA樣品；

6.混勻后輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，嚴(yán)格消除管內(nèi)氣泡；

7.測定混合液的RI，調(diào)節(jié)RI至1.4020 ± 0.0001。弱RI較低時(shí)可添加CsCl預(yù)配液增濃，較高時(shí)添加TE buffer稀釋；

8.注入CsCl平衡溶液至瓶口位置，完成封液；示意圖如下：

圖2. CsCl平衡溶液的封液示意圖

9.將SIP離心管兩兩配平 (兩管間誤差需小于0.0010 g)，將離心管口熱封后，對稱放入轉(zhuǎn)子中；配平時(shí)往較輕的離心管中添加CsCl平衡溶液，不可從管中取出，避免DNA樣品的損失；

10.超速離心條件：57000 x g，48 h，20 °C；離心不足將導(dǎo)致DNA分層效果不佳；

11.離心完成后盡快取出，平穩(wěn)取出轉(zhuǎn)子，進(jìn)行一下步分層收集。

四、分層接管

1.每一管超速離心樣品預(yù)計(jì)分為24層；將提前滅菌的離心管寫上對應(yīng)編號(hào);

2.打開分層取樣泵，每管超離樣品分24層，每層取樣20 s，設(shè)定流速為595 ul/min；

注：實(shí)驗(yàn)前可提前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察取樣情況，調(diào)整合適的流速。

3.小心剪去離心管瓶頸，注意瓶口要剪平；裝入收集臺(tái)并壓緊，上提針頭，扎破瓶底；

注：使用前可利用清水測試管路氣密性，確保氣密性良好再上樣。

4.開啟取樣泵，借用計(jì)時(shí)器手動(dòng)接管，觀察出液管路，以管路中連續(xù)液柱的第一滴液體滴出開始計(jì)算，每20 s手動(dòng)移動(dòng)至下一分層管，最后一滴可快速靠壁防止灑漏；

5.依次收集各個(gè)樣品的1-24層DNA (fraction, F1-F24, 由重至輕)；

6.不同超離管樣品采集的間隙需使用無菌水清洗管路，防止相互污染；

7.測定各層樣品的折光率RI值，并將RI值轉(zhuǎn)換成浮力密度 (Buoyant Density；BD)。

注：若分層效果較好，各層RI應(yīng)呈現(xiàn)等差遞減的趨勢。

BD值=RI *10.8601-13.4974。

8.各層樣品收集與RI測定示意圖，建議以RI=1.4002為界，選取上下10層進(jìn)行下游分析。

圖3. 各層樣品收集示意圖

五、純化回收DNA

1.配制純化溶液 (配方見表3)，根據(jù)接管所得樣品數(shù)量配制總純化溶液；

注：可以多預(yù)算5個(gè)樣品量的體積，防止分加純化溶液過程中損失。

2.往各層收集樣品中加入1106 ul純化溶液，置于4 °C冰箱過夜反應(yīng) (幫助核酸沉淀)；

注：由于每管的第1、2層和第23、24層誤差較大故可不進(jìn)行純化回收，僅回收剩余20層。

3.各分層管子離心30 min (11000 x g，4 °C)，離心完后緩慢傾斜離心管小心倒掉管中液體；

4.將離心管放入真空濃縮儀內(nèi)進(jìn)行干燥 (D-AL模式，45 °C，20 min)；直至離心管內(nèi)已無肉眼可見水珠；

5.干燥完畢后，加30 ul ddH2O或TE buffer，震蕩混勻，用掌上離心機(jī)離心5 s，放入-20 °C冰箱內(nèi)長期保存；

注：若短時(shí)間內(nèi)馬上進(jìn)行下游分子生物學(xué)分析可先放在4 °C冰箱中保存。

6.純化后再次 測定各層樣品的浮力密度BD值 。

六、熒光定量qPCR分析

1.利用qPCR方法對各層DNA量進(jìn)行定量測定，以判斷標(biāo)記、分層效果；

2.選取純化回收之前所得的浮力密度BD值在1.69 - 1.78之間的分層DNA進(jìn)行測試；

3.qPCR檢測的目標(biāo)基因可以是16S rRNA (乙酸為例)，或其他功能基因；

4.將qPCR所需試劑和選取的DNA樣品提前放入4 °C冰箱解凍、離心搖勻；

5.按照qPCR kit說明書配置20 ul 反應(yīng)溶液；

6.qPCR模板包括各層樣品、標(biāo)注曲線、陰性對照，且均需三個(gè)實(shí)驗(yàn)平行；

qPCR反應(yīng)程序根據(jù)目標(biāo)基因進(jìn)行設(shè)定，本文使用16S rRNA檢測程序如下：

Step1：95 °C，15min (預(yù)變性)

Step2：94 °C，15 s；55 °C，30s ；72 °C，30 s；44個(gè)循環(huán) (擴(kuò)增)

Step3：72 °C 7 min

Step4：起始溫度94 °C，終止溫度94 °C，溫度變化速率為0.5 °C (溶解曲線)

Step5：讀板

記錄qPCR結(jié)果，換算得到各層DNA樣品的基因濃度，繪制漸變曲線。

七、16S rRNA測序與生物信息學(xué)分析

1.參考qPCR結(jié)果，若13C-乙酸12C-乙酸兩組樣品錯(cuò)峰明顯，表明標(biāo)記效果較好，可繼續(xù)對各層DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增子測序；

2.為減少測序成本，可根據(jù)qPCR結(jié)果選取各峰尖、及左右各一層，共3個(gè)樣品測序。

3.使用Earth Microbiome Project推薦的引物對基因組DNA的16S rRNA片段進(jìn)行高通量測序 (Illumina MiSeq PE250)；主要分析細(xì)菌群落組成；

4.下機(jī)數(shù)據(jù)主要使用QIIME2分析，包括序列除雜、過濾、拼接、去噪、注釋等主要過程；

5.根據(jù)物種豐度統(tǒng)計(jì)表，繪制各樣品不同分層下的物種變化圖。

八、宏基因組測序與生物信息學(xué)分析

1.經(jīng)過¹³C標(biāo)記的重層DNA大大簡化了乙酸降解功能菌群的生物信息，從而減少冗余數(shù)據(jù)的干擾，極大地降低了生物信息分析難度；

2.重點(diǎn)針對重層DNA進(jìn)行宏基因組測序 (Illumina HiSeq PE250)，測序數(shù)據(jù)量建議不低于6 G/樣品；

3.下機(jī)數(shù)據(jù)主要使用Kneaddata進(jìn)行質(zhì)控、除雜、過濾；

4.利用Megahit軟件對優(yōu)化序列進(jìn)行拼接；

5.使用MetaWRAP進(jìn)行分箱 (包括metaBAT2、CONCOCT、MaxBin2三種主流方法)，將短序列逐一組裝成單菌基因組草圖 (Bins)，建議拼裝完整度 > 70 %，污染率 < 10 %；

6.使用CheckM評估組裝得到的Bins的質(zhì)量，如基因組大小、完整性、雜合度等主要參數(shù)；

7.使用Salmon對各個(gè)Bins進(jìn)行基因定量；

8.使用Prokka軟件預(yù)測目標(biāo)Bins的基因結(jié)構(gòu)；

9.利用Diamond軟件作KEGG/ COG/eggNOG基因功能注釋，分別獲得KO和EC號(hào)后，進(jìn)一步對功能基因作富集分析和通路分析；

10.重點(diǎn)關(guān)注與乙酸降解密切相關(guān)的功能基因或代謝途徑。

結(jié)果與分析

一、共培養(yǎng)標(biāo)記后的qPCR檢測結(jié)果

圖4. 定量qPCR用于指示 DNA-SIP標(biāo)記效率的示意圖

圖4所示：實(shí)驗(yàn)開始階段 (第0天)，乙酸降解功能菌的基因組DNA尚未得到¹³C標(biāo)記，故實(shí)驗(yàn)組與對照組的各層中基因拷貝數(shù)濃度較為一致。隨著標(biāo)記時(shí)長逐漸增加 (第10天)，乙酸降解功能菌的基因組DNA被¹³C標(biāo)記，從而“變重”，故其各層中的基因拷貝數(shù)將向浮力密度更大的“重層”遷移，表現(xiàn)為與¹²C-乙酸對照組明顯錯(cuò)峰，即為標(biāo)記成功。

二、16S rRNA測序結(jié)果

圖5. 標(biāo)記樣品的選擇與高通量測序

圖5所示：重點(diǎn)選取每個(gè)離心樣品的各峰尖層 (F10)、及左右兩層 (F9+F11) 進(jìn)行測序可減少測序成本。經(jīng)過物種豐度統(tǒng)計(jì)后，對比發(fā)現(xiàn)細(xì)菌A在¹³C實(shí)驗(yàn)組中富集，而在¹²C對照組中豐度較低，說明細(xì)菌A是潛在的乙酸降解菌群。而細(xì)菌B和細(xì)菌C在兩組中的豐度差異不大，不是潛在的乙酸降解菌群。說明：本文僅設(shè)置了一個(gè)對照組進(jìn)行簡要說明，讀者可根據(jù)實(shí)際情況設(shè)置更多對照組，排除假陽性標(biāo)記結(jié)果。

三、宏基因組分箱結(jié)果

圖6. 宏基因組Bins的物種注釋與功能基因注釋結(jié)果

圖6所示：重點(diǎn)針對“重層”DNA樣品進(jìn)行宏基因組測序，并采用MetaWRAP分箱組裝后一共獲得了5個(gè)高質(zhì)量的基因組草圖 (Bins)。基于KEGG、COG等功能基因注釋后，發(fā)現(xiàn)這些Bins含有特定的功能基因，可用于解釋潛在的代謝機(jī)制。其中Bin1、2、3可注釋至細(xì)菌A，與16S擴(kuò)增子結(jié)果較為吻合。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了兩種新型細(xì)菌 (Bin4、5)也可能是潛在的功能細(xì)菌，可進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹探究其物種分類及潛在代謝能力。

溶液配方

1.微宇宙培養(yǎng)的MSM溶液配方 (以1 L計(jì)，用去離子水制備)

表1. MSM溶液配方

2.離心樣品的純化溶液配方

表2. 純化溶液配方

失敗經(jīng)驗(yàn)

1.共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)探索合適的標(biāo)記時(shí)長，標(biāo)記過久容易導(dǎo)致交叉污染(Cross Feeding)，即被標(biāo)記的功能細(xì)菌殘?bào)w被其他非功能菌所捕食，導(dǎo)致非功能菌被錯(cuò)誤標(biāo)記而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

2.判斷標(biāo)記效果可利用熒光、16S rRNA-qPCR、功能基因-qPCR等方法綜合判定。

致謝

感謝廣東省科學(xué)院實(shí)施創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展能力建設(shè)專項(xiàng) (2020GDASYL-20200103086)，國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (42007357)，廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金(2019A1515110351)，中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (2019M662825 和 2020T130127)，廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目資助 (202002030271 和 202002020072)，廣東省科學(xué)院實(shí)施創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展能力建設(shè)專項(xiàng) (2019GDASYL-0103053)，廣東省“珠江人才計(jì)劃”項(xiàng)目 (2017BT01Z176 和 2017GC010570) 對本工作的大力支持。

參考文獻(xiàn)

1.Alneberg, J., Bjarnason, B. S., de Bruijn, I., Schirmer, M., Quick, J., Ijaz, U. Z., Lahti, L., Loman, N. J., Andersson, A. F. and Quince, C. (2014). Binning metagenomic contigs by coverage and composition. Nature Methods. 11(11): 1144-1146. https:///10.1038/nmeth.3103

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• 10月18-20日，微生物組-擴(kuò)增子16S分析

• 11月15-17日，微生物組-宏基因組分析

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