qPCR、二代測(cè)序NGS和數(shù)字PCR怎樣選擇？

Cheximing 2022-07-05 發(fā)布于浙江

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資料來(lái)源：MIR醫(yī)學(xué)儀器與試劑
整理：研究院小編

分子診斷是將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于疾病診斷的醫(yī)學(xué)分支學(xué)科，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究人體內(nèi)源性或外源性生物分子的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，將持續(xù)推動(dòng)分子診斷的進(jìn)步。目前常見核酸分子診斷技術(shù)涉及三個(gè)技術(shù)：熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）、高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）和數(shù)字PCR。如何選擇，我們作一下簡(jiǎn)要介紹。

QPCR通過熒光染料或熒光特異性探針標(biāo)記和追蹤PCR產(chǎn)物，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程。當(dāng)每條DNA鏈被擴(kuò)增時(shí)，熒光染料分子與雙鏈DNA結(jié)合，或者熒光分子從探針中釋放出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的積累。由于熒光積累與PCR產(chǎn)物的形成完全同步，因此可以通過軟件分析計(jì)算熒光積累的信息，得到待測(cè)樣品模板的初始濃度。而qPCR只能通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量，無(wú)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的絕對(duì)定量。

NGS一次可以測(cè)序幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)個(gè)DNA分子。在基因組水平上，NGS可以通過從頭測(cè)序獲得該物種的全長(zhǎng)序列，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。對(duì)于已知參考序列的物種，全基因組重測(cè)序可以檢測(cè)新的突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)錄組水平，NGS可以對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，并開展可變剪接、基因表達(dá)差異、發(fā)現(xiàn)新的非編碼RNA分子等研究。NGS結(jié)合染色質(zhì)免疫沉淀和甲基化DNA免疫沉淀技術(shù)，可以檢測(cè)DNA區(qū)域和基因組中與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的甲基化位點(diǎn)。NGS功能強(qiáng)大，適合探索和篩選新的生物標(biāo)志物，但實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，數(shù)據(jù)分析困難，檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本高。

數(shù)字PCR是一種絕對(duì)定量核酸分子的新技術(shù)。該技術(shù)可以直接獲得DNA分子的拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)初始樣品中核酸分子的絕對(duì)定量，不需要標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)。數(shù)字PCR已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，如拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、復(fù)雜來(lái)源樣品中低豐度核酸分子的檢測(cè)、NGS數(shù)據(jù)驗(yàn)證、miRNA等微小差異表達(dá)研究、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。在已知突變的癌癥分子標(biāo)記檢測(cè)、傳染病病原體檢測(cè)、基因組三倍體分析和基因表達(dá)分析等領(lǐng)域顯示出很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

在實(shí)驗(yàn)過程中，人們會(huì)產(chǎn)生疑問:哪種檢測(cè)技術(shù)更能達(dá)到預(yù)期的效果？通過比較突變檢測(cè)限、定量能力、操作簡(jiǎn)便性、檢測(cè)成本、適用場(chǎng)所、未知序列發(fā)現(xiàn)等，你可能會(huì)有自己的答案。

在實(shí)驗(yàn)過程中，大家會(huì)有疑問：選擇哪種檢測(cè)技術(shù)才能更好的達(dá)到預(yù)期結(jié)果？通過突變檢測(cè)限、定量能力、操作簡(jiǎn)易程度、檢測(cè)費(fèi)用、適用場(chǎng)所、發(fā)現(xiàn)未知序列等方面進(jìn)行比較，您或許會(huì)有自己的答案。

從上表來(lái)看，數(shù)字PCR因?yàn)殪`敏度高、絕對(duì)定量、適合于醫(yī)院操作等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤液體活檢、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查、感染性疾病早期診斷等臨床檢測(cè)應(yīng)用方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。NGS在檢測(cè)未知序列、未知突變、高通量多位點(diǎn)檢測(cè)方面是更好的選擇，是科研和獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室服務(wù)的好工具。qPCR適用于較常規(guī)的臨床分子診斷項(xiàng)目。

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