02

技術(shù)路線

Ginkgo seedlings were cultured in the glass greenhouse at Yangtze University

Characterization and isolation of GbMYC2s and

GbJAZs

RNA isolation and whole transcriptome sequencing

Acquisition of overexpressed A. thaliana

Transient expression analysis in G. biloba leaves

Quantitative real time PCR expression analysis

Y1H\Y2H\EMSA\BiFC\DAP-seq

03

主要結(jié)果

3.1 GbMYC2_4和GbMYC2_5的序列結(jié)構(gòu)、功能和亞細(xì)胞定位分析

對(duì)先前研究的分析表明，GbMYC2_4和GbMYC2_5在銀杏的不同組織中特異性表達(dá)（圖1A），并與TTL含量密切相關(guān)（圖1B和C）。使用特異性引物分離出兩個(gè)全長(zhǎng)開放閱讀框（ORF），分別命名為GbMYC2_4和GbMYC2_5（補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S1）。GbMYC2_4的開放閱讀框長(zhǎng)度為1893 bp，編碼631個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。GbMYC2_5的開放閱讀框包含1758 bp，編碼586個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)BLAST和序列比較的結(jié)果表明，GbMYC2_4和GbMYC2_5在N端區(qū)域具有高度保守的bHLH-MYC結(jié)構(gòu)域，在C端區(qū)域具有HLH DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖1D）。它們與其他MYC2s（包括南方紅豆杉、中國紅豆杉，擬南芥、煙草屬、玉米和青蒿）顯示出高度保守的氨基酸序列，而與AtMYC1、AtMYC-2（EGL3，屬于bHLH家族）和AtMYC6的序列相似性較差。為了研究GbMYC2_4和GbMYC2_5的亞細(xì)胞定位，我們分別在煙草葉中瞬時(shí)表達(dá)了SubN-CaMV35S:：EGFPGbMYC2_4/GbMYC2_0 p2300-CaM35S:∶H2B-mCherry，1:1）和SubN-CaMV 35S:；EGFP（對(duì)照載體）。共聚焦激光掃描顯微鏡觀察顯示，對(duì)照載體GFP信號(hào)分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中（圖1E）。相比之下，EGFP-GbMYC2_4/GbMYC2_5的GFP信號(hào)僅在細(xì)胞核中檢測(cè)到，并與H2B-mCherry信號(hào)共定位（圖1E），表明GbMYC2_4和GbMYC2_0都位于細(xì)胞核中。

3.2 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)萜烯三內(nèi)酯的積累和GbMYC2s的上調(diào)。

當(dāng)在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，野生型和過表達(dá)系都健康生長(zhǎng)。然而，當(dāng)添加25μM MeJA時(shí)，過表達(dá)GbMYC2的擬南芥系的根長(zhǎng)與野生型一樣受到抑制，但野生型和過表達(dá)植物的根長(zhǎng)基本相同（圖2A）。當(dāng)MeJA濃度提高到50μM時(shí)，野生型擬南芥品系的根長(zhǎng)與在含有25μM MeJA的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的相似，但轉(zhuǎn)基因品系的初生根生長(zhǎng)受到更強(qiáng)烈的抑制，尤其是對(duì)MeJA表現(xiàn)出更強(qiáng)敏感性的品系4319、5319、5317和5321（圖2A）。使用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC-ELSD）測(cè)定銀杏植物中的TTL含量。

3.3 GbMYC2_4和5積極調(diào)節(jié)萜三內(nèi)酯的生物合成

為了充分闡明GbMYC2_4和5在TTL積累中的作用，它們?cè)阢y杏葉中短暫過表達(dá)。過表達(dá)GbMYC2_4的葉片中的TTL含量為1.6221 mg/g FW，顯著高于注射空載體的葉片中TTL含量[對(duì)照組，空載體（CK），1.3128 mg/g FW]（圖1F）。SK-GbMYC2_5-過表達(dá)葉片中的TTL含量為1.6581 mg/g FW，顯著高于CK（圖1F）。這些結(jié)果表明，GbMYC2_4和GbMYC2_5能夠促進(jìn)銀杏葉片中TTL的積累。

3.4 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)萜類三內(nèi)酯的積累和GbMYC2s的上調(diào)

當(dāng)在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，野生型和過表達(dá)系都健康生長(zhǎng)。然而，當(dāng)添加25μM MeJA時(shí)，過表達(dá)GbMYC2的擬南芥系的根長(zhǎng)與野生型一樣受到抑制，但野生型和過表達(dá)植物的根長(zhǎng)基本相同（圖2A）。當(dāng)MeJA濃度提高到50μM時(shí)，野生型擬南芥品系的根長(zhǎng)與在含有25μM MeJA的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的相似，但轉(zhuǎn)基因品系的初生根生長(zhǎng)受到更強(qiáng)烈的抑制，尤其是對(duì)MeJA表現(xiàn)出更強(qiáng)敏感性的品系4319、5319、5317和5321（圖2A）。使用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC-ELSD）測(cè)定銀杏植物中的TTL含量。銀杏樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰如圖2B所示。MeJA處理能夠誘導(dǎo)TTL積累，并在4小時(shí)達(dá)到最大含量，隨后逐漸減少（圖2B）。與0小時(shí)（1109.6μg/g FW）相比，MeJA誘導(dǎo)后TTL含量增加了8.7-14.6%（1206.4-1271.9μg/g FW。為了確認(rèn)GbMYC2是否對(duì)MeJA有反應(yīng)，使用qRT-PCR在不同時(shí)間點(diǎn)分析了MeJA處理后GbMYC2_4和GbMYC2_5的表達(dá)水平。結(jié)果表明，MeJA能有效誘導(dǎo)GbMYC2_4和GbMYC2_5的表達(dá)。GbMYC2_4和GbMYC2_5的轉(zhuǎn)錄水平在MeJA處理2小時(shí)后迅速增加，在2小時(shí)達(dá)到峰值，然后緩慢下降，直到12小時(shí)（圖2C和D）。相關(guān)性分析顯示，GbMYC2_4（圖2C，r=0.54，P<0.05）和GbMYC2_5（圖2D，r=0.54（P<0.05））的表達(dá)水平與TTL含量高度相關(guān)。

3.5 GbMYC2與GbJAZ蛋白相互作用

為了確定GbMYC2_4和GbMYC2_5是否與JAZ蛋白相互作用，我們從銀杏cDNA文庫中克隆了7個(gè)GbJAZ。首先，qRT-PCR分析表明，除JAZ5外，六個(gè)JAZ的MeJA誘導(dǎo)變化趨勢(shì)基本相同。

進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明，JAZ5的表達(dá)變化與GbMYC2_4和GbMYC2_5相反。接下來，以BD為空作為對(duì)照，對(duì)兩個(gè)MYC2及其片段（N、M、C-GbMYC2）進(jìn)行自動(dòng)激活。自動(dòng)激活試驗(yàn)表明，在沒有獵物蛋白的情況下，GbMYC2_4、GbMYC2_5及其截短片段（N、M、C-GbMYC2）誘餌不能自主激活Y2HGold菌株中的報(bào)告基因。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用了GbMYC2_4和5及其截短片段。

最后進(jìn)行Y2H測(cè)定。Y2H分析表明，GbMYC2_4和N-GbMYC2_4可以與GbJAZ1/2/3/4/6/7蛋白相互作用。GbMYC2_5、N-GbMYC2_0和C-GbMYC2_6可以與Y2H酵母細(xì)胞中的GbJAZ1/2/3/4/7蛋白相互作用（圖3A）。GbMYC2_4和GbMYC2_5都不能與JAZ5相互作用，GbMYC2_0不能與GbJAZ6相互作用。

為了探索GbJAZ和MYC2s之間相互作用的特異性，將去除Jas區(qū)的N-JAZ2和N-JAZ4片段用于Y2H實(shí)驗(yàn)。如圖3B所示，N-JAZ2和N-JAZ4都不能與GbMYC2_4和GbMYC2_5相互作用。此外，還進(jìn)行了BiFC測(cè)定，以檢查煙草植物中的GbMYC2-GbJAZ相互作用。當(dāng)nEYFPGbMYC2_4分別與cEYFP-GbJAZ1/2/3/4/6/7在野生底棲豬籠草葉片中共表達(dá)時(shí)，在葉片表皮細(xì)胞核中檢測(cè)到強(qiáng)烈的黃色YFP熒光，并與H2BmCherry信號(hào)共定位（圖3C）。如圖3C所示，nEYFP-GbMYC2_5和cEYFP-GbJAZ1/2/3/4/7共表達(dá)后，在細(xì)胞的細(xì)胞核中觀察到強(qiáng)烈的熒光。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GbMYC2_4和5與GbJAZ的相互作用。

3.6 MYC2調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄組分析

為了進(jìn)一步鑒定可能受GbMYC2_4和GbMYC2_5調(diào)節(jié)的TTL生物合成酶基因，使用CK（對(duì)照組，空載體）、M4（GbMYC2_6的過表達(dá)）和M5（GbMYC22_5的過表達(dá)”）的三個(gè)生物復(fù)制品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?？紤]到CYP基因在TTL生物合成中的直接作用[11]，鑒定出差異表達(dá)的CYP基因。對(duì)M4、M5和CK轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)分析（補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S2）。我們從CK和M4中鑒定出1047個(gè)上調(diào)基因和1418個(gè)下調(diào)基因（圖4A），其中10個(gè)CYP基因上調(diào)（圖4B）。在CK與M5對(duì)照組中，我們共鑒定出302個(gè)上調(diào)基因和253個(gè)下調(diào)基因（圖4A），其中13個(gè)CYP基因、1個(gè)HMGR、1個(gè)PMK和1個(gè)GGPPS上調(diào)（圖4C）。此外，我們分別從CK與M4和CK與M5中鑒定出14個(gè)和21個(gè)MYC2上調(diào)的TF（圖4B和C）。這些轉(zhuǎn)錄因子屬于MYB、ERF、MADS、NAC、bZIP和bHLH家族，可能參與調(diào)節(jié)TTL生物合成。KEGG富集分析顯示，在CK與M4和CK與M5的比較中，分別有26條和37條途徑（Q值≤0.05）顯著富集。觀察到兩組中總共有八條途徑顯著富集。在這八條途徑中，有六條與代謝有關(guān)，即苯丙烷類生物合成、淀粉和蔗糖代謝、氰基氨基酸代謝、黃酮類生物合成、二苯乙烯類、二芳基庚烷類和姜酚類生物合成以及色氨酸代謝。此外，除了單萜生物合成、泛醌和其他與萜類合成代謝相關(guān)的萜類醌生物合成外，CK與M4比較中還顯著富集了其他幾種主要代謝機(jī)制，如MAPK信號(hào)通路、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、甘油磷脂代謝和玉米素生物合成。在CK與M5的比較中，有三種與萜類化合物的代謝有關(guān)，即類胡蘿卜素生物合成、二萜生物合成和吲哚生物堿生物合成；其他幾種主要代謝機(jī)制，如光合作用、MAPK信號(hào)通路、DNA復(fù)制、氨基糖和核苷酸糖代謝、果糖和甘露糖代謝以及晝夜節(jié)律，也得到了顯著豐富。

3.7 DAP-seq鑒定GGPPS作為GbMYC2_4靶基因

為了找到GbMYC2_4可能的下游靶基因，我們使用GbMYC2_4作為誘餌，選擇DAP-seq方法來鑒定下游靶基因[30,31]。我們分別從兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中鑒定出72 763個(gè)和66 045個(gè)峰，其中44 565個(gè)峰是共享的（補(bǔ)充數(shù)據(jù)圖S3A）。GbMYC2_4結(jié)合位點(diǎn)集中在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，主要分布在遠(yuǎn)端基因間和內(nèi)含子區(qū)域（圖5A）。富集分析表明，G-盒基序（GCACGTGC）是GbMYC2_4結(jié)合峰富集度最高的基序之一（圖5B）。除了G-box，我們還確定GbMYC2_4結(jié)合了其他五個(gè)未鑒定的基序，序列為AMCATATGBT、CCAYGCCCCWYTTAGGGGTT、TRTGCACAAAA、CACATTWAACACATG和AAATRGGGYRCARGAA（補(bǔ)充數(shù)據(jù)圖S3B-G）。在DAP-seq數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)GbMYC2_5的靶標(biāo)GbGGPPS啟動(dòng)子也是GbMYC2_4的候選靶基因。一致的是，我們?cè)贕bGGPPS的啟動(dòng)子區(qū)域檢測(cè)到強(qiáng)烈的GbMYC2_4結(jié)合峰（圖5C），并且該峰被注釋為GGPPS_Pro3的啟動(dòng)子序列。Y1H測(cè)定結(jié)果表明，GbMYC2_4能夠與GbGGPPS_Pro3結(jié)合（圖5D）。進(jìn)一步分析表明，GbGGPPS_Pro3含有GbGGPPS_ Pro1；然而，GbMYC2_4不能與GbGGPPS_Pro1結(jié)合（圖5E）。

3.8 GbMYC2_5正向調(diào)節(jié)GbGGPPS表達(dá)

轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，GbMYC2_5過表達(dá)誘導(dǎo)了GbGGPPS的上調(diào)表達(dá)（圖4C），因此GbGGPPS可能是GbMYC2_4的潛在靶點(diǎn)。進(jìn)一步的分析表明，GbGGPPS啟動(dòng)子的-1203至-1034區(qū)域（GGPPS_Pro1）包含兩個(gè)G盒（圖6A），通過酵母單雜交（Y1H）檢測(cè)GbMYC2_5與GGPPS_Pro1的結(jié)合活性。Y1H試驗(yàn)表明，用AD-GbMYC2_5和pAbAi-GbGGPPS_Pro1轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在所選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，而用ADempty和pAbAi-GbGGPPS_Pro1轉(zhuǎn)換的酵母細(xì)胞不生長(zhǎng)（圖6B）。

此外，我們研究了GbMYC2_5與GbGGPPS_Pro2的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)含有AD-GbMYC2_6和pAbAiGbGGPPS_ Pro2質(zhì)粒的酵母細(xì)胞無法在所選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（圖6B）。這些結(jié)果表明，GbMYC2_5可以與GbGGPPS啟動(dòng)子的G-box1結(jié)合（-1203至-1136 bp區(qū)域）。MYC2通過識(shí)別和結(jié)合G-box或G-box樣基序來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[32,33]，因此選擇了9個(gè)參與TTL生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行Y1H測(cè)定，這些基因的啟動(dòng)子中含有G-box或G-box樣基模序。具體而言，TTL合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子分析表明，LPS、AACT1、AACT2、HMGR1、HMGR2、HMGS、DXS1、DXS2和GGPPS2基因的啟動(dòng)因子包含一個(gè)G-box或G-box樣基序（補(bǔ)充數(shù)據(jù)圖S4A）。然而，這九個(gè)啟動(dòng)子不是GbMYC2_5的靶標(biāo)（補(bǔ)充數(shù)據(jù)圖S4C）。

我們還通過EMSA分析進(jìn)一步證實(shí)了GbMYC2_5與GbGGPPS啟動(dòng)子的結(jié)合活性。我們根據(jù)G盒在GbGGPPS啟動(dòng)子中的位置設(shè)計(jì)了P1、P1突變體和P2探針（圖6A）。我們發(fā)現(xiàn)GbMYC2_5蛋白可以結(jié)合P1序列，但不能結(jié)合P1突變體和P2序列（圖6C）。與這一觀察結(jié)果一致，過多的未標(biāo)記探針（冷P1、20×和50×）與標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GbMYC2_5并消除遷移（圖6C），表明GbMYC2_0特異性結(jié)合GbGGPPS啟動(dòng)子中的P1序列。為了進(jìn)一步確定GbMYC2_5的激活效應(yīng)，創(chuàng)建了由GbGGPPS_Pro1和GbGGPPS_ Pro2驅(qū)動(dòng)的兩個(gè)螢火蟲LUC報(bào)告構(gòu)建體，同時(shí)使用GbMYC2_0生成了一個(gè)效應(yīng)器（圖6D）。GbGGPPS_Pro1比GbGGPPS_ Pro2多一個(gè)包含G-box的啟動(dòng)子片段（圖6A）。

瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，與含有GbGGPPS_Pro1的報(bào)告子共表達(dá)的效應(yīng)子激活了2.37倍的LUC，用GbGGPPS_ Pro2替換GbGGPPSS_Pro1導(dǎo)致活性急劇下降（圖6E）。這些結(jié)果表明，GbMYC2_5通過與G-box結(jié)合而充當(dāng)GbGGPPS的轉(zhuǎn)錄激活因子，并且可以特異性地選擇和結(jié)合G-box。為了探究GbMYC2_5更傾向于與G-box1結(jié)合的原因，對(duì)GbGGPPS啟動(dòng)子的仔細(xì)檢查表明，Gbox2附近區(qū)域（延伸前后8 bp，11/16）的a/T含量低于G-box1附近區(qū)域（14/16）（圖6F）。基于GbGGPPS啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)了兩個(gè)人工重復(fù)的G-box1（Gbox1×2）和一個(gè)突變體（mG-box1×2，見圖6F）。Y1H測(cè)定的結(jié)果表明，GbMYC2_5與Gbox1×2結(jié)合，但不與突變體結(jié)合（圖6G）。G-box1×2和mG-box1 x 2之間的區(qū)別在于，Gbox附近的G/C含量增加了（2/16到6/16）。因此，這些結(jié)果表明，GbMYC2_5傾向于結(jié)合附近區(qū)域A/T含量較高的G盒。

04

結(jié)論

基于上述發(fā)現(xiàn)，我們確定了JA介導(dǎo)的GbJAZ-GbMYC2模塊調(diào)節(jié)銀杏TTL合成的分子機(jī)制。在這里，我們提出了一個(gè)工作模型來了解GbJAZ-GbMYC2如何調(diào)節(jié)JA信號(hào)中的TTL合成（圖7）。在正?；虻退降腏A下，GbJAZ與GbMYC2相互作用以抑制GbMYC2活性。當(dāng)外源性MeJA處理增加銀杏中的JA水平時(shí)，它會(huì)觸發(fā)JA信號(hào)通路中GbJAZ的降解并釋放GbMYC2。作為JA誘導(dǎo)的結(jié)果，GbMYC2與GbGGPPS啟動(dòng)子中的Gbox結(jié)合，并激活其表達(dá)以促進(jìn)TTL的合成，最終增加TTL在葉片中的積累。我們的研究揭示了MeJA誘導(dǎo)TTL積累的分子機(jī)制，并為MYC2調(diào)節(jié)萜類化合物合成提供了新的證據(jù)，從而為培育高TTL含量的銀杏提供了新方法。