今天要分享的這篇文章中作為實(shí)驗(yàn)主體的轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)只測(cè)了5個(gè)樣品，刊在了2017年9月的Scientific Reports上，大家先一起來(lái)看看吧。 研究背景及目的： 丹參（Salvia miltiorrhiza）是中國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，其生物活性成分主要可以分為兩類(lèi)：水溶性的酚酸、二萜類(lèi)丹參酮。已有研究證明茉莉酸甲酯（MeJA）可以同時(shí)提高酚酸和丹參酮的產(chǎn)量，而酵母分泌物（YE）只能誘導(dǎo)丹參酮的積累。作者通過(guò)使用這兩種誘導(dǎo)劑對(duì)丹參毛狀根進(jìn)行處理，觀察處理前后組織在化合物含量及基因表達(dá)層面的變化，以期研究?jī)深?lèi)活性物質(zhì)生物合成的分子機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：分別用MeJA和YE處理丹參的毛狀根，并在處理后1h、6h、12h取樣。 1. 化合物檢測(cè)：使用HPLC對(duì)未經(jīng)處理的毛狀根（control）以及用兩種誘導(dǎo)劑處理之后1h、6h、12h的毛狀根進(jìn)行酚酸類(lèi)物質(zhì)（包含Sal A, Sal B , CA）和丹參酮類(lèi)物質(zhì)（包含DT, CT, T1, T2A）含量的測(cè)定； 2. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：對(duì)未經(jīng)處理的毛狀根（control），MeJA處理后1h、6h，YE處理后1h、12h，總計(jì)5個(gè)樣品進(jìn)行RNA-seq（每個(gè)樣品由3個(gè)丹參個(gè)體混合而成）。 化合物檢測(cè)結(jié)果 化合物含量檢測(cè)結(jié)果：MeJA處理組，丹參的總酚酸含量最高增多了0.56倍，總丹參酮含量最高增多了1.94倍；YE處理組，丹參的總丹參酮含量最高增多了4.47倍。誘導(dǎo)作用還是很顯著的。
圖注：圖A為MeJA誘導(dǎo)之后毛狀根的丹參酮類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果；圖B為YE誘導(dǎo)之后毛狀根的丹參酮類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果；圖C為MeJA誘導(dǎo)之后毛狀根的酚酸類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果；圖D為YE誘導(dǎo)之后毛狀根的酚酸類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)概述及標(biāo)準(zhǔn)分析 測(cè)序數(shù)據(jù)概述：5個(gè)樣品下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾之后分別得到了27M~41M不等的reads（Hiseq 2000，PE100），換算成堿基數(shù)量，相當(dāng)于5.4G~8.2G的clean data。利用Trinity軟件組裝得到了55588條unigenes，N50為1772bp，其中42458條得到了注釋信息。 差異基因注釋統(tǒng)計(jì)： MeJA處理組相對(duì)于對(duì)照組檢測(cè)到5767個(gè)上調(diào)基因（篩選標(biāo)準(zhǔn)FC>2，F(xiàn)DR<0.01，下同），YE處理組相對(duì)于對(duì)照組檢測(cè)到5767個(gè)上調(diào)基因4482。對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集之后，作者統(tǒng)計(jì)了不同比對(duì)組差異基因中富集程度最高的5個(gè)功能類(lèi)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)MeJA處理組在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、苯丙烷合成、代謝通路、通過(guò)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的倍半萜和三萜類(lèi)生物合成等相關(guān)的差異基因要明顯多于YE處理組。相對(duì)的，YE處理組在植物病原菌互作、萜類(lèi)化合物相關(guān)的差異基因要遠(yuǎn)多于MeJA處理組。 先尋找已知相關(guān)基因的表達(dá)情況 酚酸及丹參酮合成相關(guān)基因分析： 根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)提供的酚酸和丹參酮生物合成相關(guān)基因信息，在此次轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到丹參酮相關(guān)的66個(gè)基因能夠編碼26種酶，同時(shí)鑒定到酚酸合成相關(guān)的37個(gè)基因能夠編碼17種酶。 具體到Y(jié)E處理組，有50個(gè)丹參酮合成相關(guān)基因發(fā)生了差異表達(dá)，這要多于MeJA處理組中的33個(gè)。但是MeJA處理組有6個(gè)和酚酸合成相關(guān)基因產(chǎn)生了差異表達(dá)，而在YE處理組里并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種情況。可以推測(cè)YE比MeJA對(duì)丹參酮合成發(fā)揮了更大的作用，但是只有MeJA對(duì)酚酸的合成產(chǎn)生明顯的作用，這和HPLC的檢測(cè)結(jié)果相一致。此外作者對(duì)丹參酮合成相關(guān)的12個(gè)基因、酚酸合成相關(guān)的7個(gè)基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果相當(dāng)一致。 響應(yīng)誘導(dǎo)劑處理的P450s基因：細(xì)胞色素P450s是植物中幾個(gè)最大的超級(jí)基因家族之一，參與了很多代謝活動(dòng)。作者通過(guò)基因共表達(dá)分析的方法，在MeJA處理組從上調(diào)的P450基因家族中找到了45個(gè)與CPS1, KSL1, CYP76AH1（這三個(gè)是已報(bào)道的與丹參酮積累相關(guān)的基因）存在共表達(dá)關(guān)系的基因，在YE處理組找到了27個(gè)基因。然后將這45+27個(gè)基因連同其他植物的P450s基因進(jìn)行了NJ進(jìn)化樹(shù)分析，進(jìn)而對(duì)這45+27個(gè)基因進(jìn)行了分類(lèi)。
圖注：P450基因家族與已知參與活性物質(zhì)合成相關(guān)基因的共表達(dá)分析結(jié)果 接著用同樣的方法從上調(diào)的P450s基因家族中找到了26個(gè)與TAT1, HPPR1 ， RAS1（確認(rèn)參與酚酸代謝通路的基因）有類(lèi)似表達(dá)模式的基因。2個(gè)已經(jīng)被報(bào)道在酚酸和丹參酮合成過(guò)程中有關(guān)鍵作用的基因（P98A14和CYP76AH1），在MeJA處理組檢測(cè)到了上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步確定了這2個(gè)基因的作用。 還得看看參與下游代謝反應(yīng)的基因 參與丹參酮和酚酸生物合成的下游候選基因的鑒定： 根據(jù)已有報(bào)道，脫羧基酶、脫氫酶、還原酶在丹參酮合成的下游反應(yīng)中起作用。于是作者在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中尋找與姜的短鏈脫氫酶ZSD1、青蒿的aldehyde Δ11(13)還原酶DBR2有較高同源性的序列，最終找到13條與這兩個(gè)基因有42%以上同源性的序列，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，這13個(gè)基因在兩個(gè)處理組中均有顯著的高表達(dá)，預(yù)示著脫氫酶和還原酶在丹參酮的合成過(guò)程中起到了作用。 根據(jù)已有報(bào)道，漆酶可能是催化迷迭香酸生成丹酚酸A的催化酶，作者將毛竹的兩個(gè)漆酶相關(guān)基因Lap1A和Lap2的序列在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)里進(jìn)行檢索，找到了7個(gè)類(lèi)似的基因。 再加上轉(zhuǎn)錄因子的分析就圓滿(mǎn)了 響應(yīng)誘導(dǎo)劑處理的轉(zhuǎn)錄因子： 作者鑒定并篩選出了375個(gè)在處理前后有差異上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，這比已報(bào)道的數(shù)量要多，但是包含WRKY, bHLH, AP2-EREBP和NAC在內(nèi)的四類(lèi)主要轉(zhuǎn)錄因子都表現(xiàn)出了上調(diào)的表達(dá)模式，這和前人的研究是一致的。 已有研究報(bào)道WRKY,AP2-EREBP, MYB, GRAS和bHLH在植物次級(jí)代謝調(diào)控中有重要作用，作者鑒定了兩個(gè)處理組間獨(dú)有及共有的并屬于上述4個(gè)家族的轉(zhuǎn)錄因子。作者描述了這四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族已知的作用，并結(jié)合它們?cè)趦蓚€(gè)處理組中不同的表達(dá)情況，來(lái)推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子在丹參酮和酚酸合成中起到的作用。 這樣看來(lái)是不是您也可以呢？ 文章到這里就說(shuō)完了，這篇文章在實(shí)驗(yàn)方面做了5個(gè)轉(zhuǎn)錄組、幾十個(gè)qRT-PCR、測(cè)定了7種化合物，都是很成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，大家可以很方便的委托公司或者自行完成。但是作者在分析方面花的心思可不少，從幾千個(gè)差異基因中找到幾十個(gè)與目標(biāo)相關(guān)的基因，共表達(dá)分析有協(xié)同作用的P450s基因，鑒定活性物質(zhì)合成上游的轉(zhuǎn)錄因子、參與下游反應(yīng)的候選基因，每一步都大量借鑒了前人已有的研究基礎(chǔ)，并引用自己的數(shù)據(jù)對(duì)已有結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證、拓展和升華。已報(bào)道的文獻(xiàn)為分析提供了引導(dǎo)方向，作者自身對(duì)數(shù)據(jù)的理解讓分析走的更深遠(yuǎn)，所以說(shuō)想少花錢(qián)多辦事，不僅得站在巨人的肩膀上，還得修煉好自身??！ |
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來(lái)自： Omicsclass > 《文獻(xiàn)》
