肝細胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的一種，占病例的大部分。晚期HCC侵襲性強，預后差。根據(jù)WHO數(shù)據(jù)，HCC是全球第六大常見腫瘤，第三大致死癌癥，五年生存率約18%。早期HCC患者有多種治療選擇，如手術、消融術和肝臟移植，手術切除尤其適用于局限性腫瘤患者。盡管治療方案多樣，但早期診斷困難，晚期患者需化療栓塞和全身治療。索拉非尼是FDA批準的晚期HCC標準治療藥物，但耐藥性限制了其效果。因此，對于HCC治療的突破性進展仍需進一步研究。

四物湯（SWD），是補血調經(jīng)、滋補肝腎的傳統(tǒng)良方，由當歸、川芎、白芍及熟地黃四味藥材構成，臨床上主要用于治療嚴重貧血、月經(jīng)失調、痛經(jīng)等癥狀。該方劑中的有效成分涵蓋了有機酸、苷類、內酯類、黃酮類及生物堿類等?，F(xiàn)代藥理學研究揭示，這些成分具備抗腫瘤、護肝、抗氧化及鎮(zhèn)痛等多重藥理活性。此外，SWD與其他藥物并用，通常能展現(xiàn)出更佳的治療效果。

日前，一篇題為“Siwu decoction suppress myeloid-derived suppressor cells through tumour cells necroptosis to inhibit hepatocellular carcinoma”的研究文章，深入探討了SWD在抑制HCC方面的潛在作用機制。

圖1 論文首頁

SWD對HCC細胞的生長有抑制作用

圖2A展示了SWD的組成，研究采用高效液相色譜法（HPLC）對SWD的化學成分進行了分析，成功鑒定出五種特征化合物（圖2B）。此外，研究將表達熒光素酶的MHCC97L細胞源性皮下腫瘤植入小鼠左葉，體積為1mm3。并將實驗小鼠隨機分為三組（每組n=6），每兩天一次分別給予蒸餾水（灌胃200 μl）、低劑量SWD（0.758 g/kg，灌胃200 μl）和高劑量SWD（1.516 g/kg，灌胃200 μl），連續(xù)治療四周，干預期間，小鼠體重未發(fā)生明顯減輕（圖2C）。研究還在移植后每周向小鼠注射D-熒光素鈉鹽（15 mg/kg,i.p），并利用IVIS系統(tǒng)觀察動物。結果顯示，在第四周時，低劑量和高劑量SWD組的熒光信號強度均低于對照組，且高劑量組的熒光信號強度低于低劑量組，表明SWD治療能以劑量依賴性方式抑制小鼠肝臟中HCC的生長（圖2D）。

隨后，研究對肝臟進行解剖并測量腫瘤大小，進一步證實了SWD干預對HCC的抑制效果（圖2E）。組織學檢查顯示，對照組腫瘤邊界模糊，向鄰近肝組織浸潤，而SWD組腫瘤邊界清晰，表明SWD能夠抑制HCC腫瘤的局部浸潤（圖2F）。研究還觀察了HCC細胞的轉移情況，發(fā)現(xiàn)高劑量SWD組未見明顯熒光素信號，表明高劑量SWD能顯著阻斷HCC向肺組織的轉移（圖2G）。同時，心臟、脾臟、腎臟和腸道等主要器官，亦未發(fā)現(xiàn)形態(tài)學變化，表明SWD干預小鼠的主要器官在外觀和組織學上均未見異常（圖2H）。綜上所述，SWD是一種有效且安全的抑制HCC的中藥配方。

圖2 SWD抑制HCC的體內生長

SWD在體內外均可誘導HCC的壞死反應

為深入探究SWD對HCC的抑制效應，研究對SWD處理與否的小鼠腫瘤組織切片中腫瘤增殖標志物Ki67和微血管標志物CD31的表達進行了檢測。結果顯示，SWD顯著降低了Ki67和CD31的表達水平，這暗示了SWD處理能夠抑制腫瘤的生長及HCC內部的血管生成（圖3A）。為驗證這一效應是否與SWD對HCC細胞的直接細胞毒性相關，研究在體外對人HCC細胞系MHCC97L、Huh7和PLC/PRF/5進行了培養(yǎng)，并施以不同濃度的SWD處理。結果顯示，SWD對這三種細胞系均表現(xiàn)出劑量依賴性的細胞毒性，而對正常肝實質細胞AML12的影響則微乎其微。特別是MHCC97L細胞系對SWD的IC50值最高（33.12±3.30 mg/ml），表明其對體外SWD的敏感性較低（圖3B）。這提示，SWD的抗HCC作用不僅與其對腫瘤細胞的直接影響相關，還可能與其對腫瘤微環(huán)境（TME）的調節(jié)作用有關。

為了進一步闡釋SWD如何發(fā)揮其抗HCC作用，研究比較了SWD處理組與未處理組的組織學差異。結果顯示，SWD處理組的腫瘤壞死面積大于對照組（圖3C）。Western blot分析顯示，SWD在體外處理時能夠劑量依賴性地誘導MHCC97L和PLC/PRF/5細胞的壞死反應，表現(xiàn)為RIPK1、RIPK3和p-MLKL表達的增加，進而促進HCC細胞產(chǎn)生IL-1B（圖3D）。隨著SWD劑量的增加，RIPK3、Caspase8、MLKI和IL-1B的表達亦相應增加，表明SWD能夠劑量依賴性地誘導小鼠HCC的壞死反應（圖3E）。免疫組織化學分析揭示，SWD能夠誘導HCC腫瘤中心及邊緣區(qū)域的壞死反應，而邊緣區(qū)域的腫瘤細胞更多地誘導RIPK3和caspase8的表達（圖3F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，SWD誘導的HCC細胞壞死反應可能是觸發(fā)主要位于腫瘤邊緣TME中另一組細胞凋亡的原因。

圖3 SWD誘導HCC在體內外的壞死反應

SWD誘導的HCC細胞壞死反應觸發(fā)MDSCs凋亡

為深入研究腫瘤微環(huán)境（TME）中的潛在細胞靶點，研究對先天免疫細胞進行了分析，涉及腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和髓源性抑制細胞（MDSCs）。結果顯示，SWD對TME中CD11b+F4/80+ TAMs細胞的數(shù)量影響甚微，但其對CD11b+Ly6G+細胞的數(shù)量具有劑量依賴性的顯著抑制作用（圖4A）。為明確CD11b+Ly6G+群體的特性，研究對細胞進行了分類，并將其與從C57BL/J小鼠脾臟中分離的CD3+CD8+細胞毒性T細胞共培養(yǎng)（圖4B）。結果顯示，細胞毒性T細胞與未經(jīng)處理小鼠的CD11b+Ly6G+細胞共培養(yǎng)時，細胞增殖及活化標志物Ki67和顆粒酶B顯著受抑，而經(jīng)SWD處理的小鼠CD11b+Ly6G+細胞對細胞毒性T細胞增殖和活化的抑制作用相對較弱（圖4C）。這表明TME中SWD針對的CD11b+Ly6G+細胞更可能屬于MDSCs。此外，SWD處理后，小鼠的MDSCs數(shù)量未見明顯變化（圖4D）。

研究發(fā)現(xiàn)，SWD不影響經(jīng)PHK-26染色的MDSCs向HCC小鼠體內的遷移。但SWD干預顯著抑制了TME中MDSCs的局部增殖（圖4E），表明SWD干預抑制了HCC的TME中MDSCs的局部擴張。為進一步探究SWD對HCC的TME中MDSCs群體的調節(jié)作用，研究在體外對MDSCs進行了SWD處理。結果顯示，在含有SWD的培養(yǎng)液中，MDSCs群體數(shù)量未見顯著變化（圖4F），表明SWD對MDSCs的成熟和分化無影響。SWD對誘導MDSCs細胞凋亡亦無影響，說明SWD對MDSCs無直接作用（圖4G）。

為確定SWD是否調節(jié)MDSCs與HCC細胞之間的細胞間通訊，研究對HCC細胞進行了SWD處理，并收集了處理后的HCC細胞培養(yǎng)上清（圖4H）。SWD處理的HCC培養(yǎng)上清對體外MDSCs群體具有顯著抑制作用。進一步分析顯示，在SWD處理的HCC培養(yǎng)上清液存在下，MDSCs更易發(fā)生細胞凋亡（圖4I）。這表明，SWD通過調節(jié)HCC細胞與MDSCs之間的相互作用，從而抑制TME中的MDSCs群體。

圖4 SWD誘導的HCC細胞壞死反應觸發(fā)了MDSCs的凋亡

體內聯(lián)合使用SWD和索拉非尼可提高索拉非尼治療HCC的療效

研究進一步探究了SWD與索拉非尼聯(lián)合應用在治療HCC方面的潛力。實驗中，HCC小鼠分別接受蒸餾水（對照組）、索拉非尼（15 mg/kg）、SWD（1.516 g/kg）以及索拉非尼與SWD聯(lián)合灌胃治療，持續(xù)4周。在聯(lián)合治療組的小鼠中，并未觀察到體重減輕的現(xiàn)象（圖5A）。盡管索拉非尼和SWD單獨使用均能抑制HCC小鼠腫瘤的進展，但聯(lián)合治療在腫瘤消退方面展現(xiàn)了更佳的療效（圖5B）。

隨后，研究對治療后的小鼠肝臟及其他主要器官進行了解剖，結果顯示，聯(lián)合治療組小鼠的腫瘤體積顯著小于單獨接受索拉非尼或SWD治療的小鼠（圖5C）。索拉非尼、SWD以及聯(lián)合治療組的熒光素酶信號明顯低于對照組（圖5D）。此外，心臟、脾臟、腎臟和腸道的外觀及組織學特征在各組間未見顯著差異（圖5E）。流式細胞術分析結果表明，索拉非尼單獨治療未能抑制TME中的MDSCs，而SWD單獨使用可能減少其數(shù)量。然而，與單獨使用SWD相比，聯(lián)合使用索拉非尼和SWD并未導致TME中MDSCs的進一步減少（圖5F），這暗示SWD和索拉非尼可能通過不同的機制抑制HCC。由此可見，SWD與索拉非尼的聯(lián)合使用能夠增強索拉非尼治療HCC的療效，并且未見明顯毒性反應。

圖5 SWD聯(lián)合使用改善了索拉非尼對HCC的療效

結論

總之，源自中國傳統(tǒng)醫(yī)藥的SWD配方能夠激發(fā)肝癌細胞的壞死過程，并間接作用于免疫抑制細胞MDSCs，從而對HCC展現(xiàn)出抑制效果。

參考文獻：

Feng Z, Chan YT, Lu Y, Wu J, Xing T, Yuan H, Feng Y, Wang N. Siwu decoction suppress myeloid-derived suppressor cells through tumour cells necroptosis to inhibit hepatocellular carcinoma. Phytomedicine. 2024 Oct;133:155913. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155913

來源：梅斯循證中醫(yī)藥