——背景——

NADPH氧化酶（NOXs）是目前已知的以產(chǎn)生活性氧物種（ROS）為唯一功能的代謝酶。在哺乳動物體內(nèi)，NOXs存在7種旁系同源基因。這些基因彼此之間具有較高的序列相似度，且催化核心均由相似的兩個結構域構成。具體來說，NOXs的N端為6條α-螺旋的跨膜區(qū)，其中四個嚴格保守的組氨酸與兩個血紅素分子結合，形成細胞膜內(nèi)的電子通道；C端為胞內(nèi)區(qū)，包含了NADPH和FAD的結合位點。然而不同NOXs的具體結構和催化產(chǎn)物不盡相同：NOX1/2/3/5催化產(chǎn)生超氧化物，后者在細胞內(nèi)會自發(fā)地轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H₂O₂）；NOX4和DUOX1-2則直接催化過氧化氫的產(chǎn)生。

NOXs所調(diào)控的ROS產(chǎn)生涉及到細胞內(nèi)的氧化還原平衡。此外，NOXs還調(diào)控固有免疫、細胞增殖等現(xiàn)象。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，NOXs基因的高表達與多種癌癥的發(fā)生相關。例如NOX1和NOX4的高表達涉及到結腸癌、乳腺癌、肺纖維化等疾病。NOX5在食管鱗狀細胞癌、前列腺癌等癌癥中高表達，而NOX2被認為與血液腫瘤高度相關。

基于NOXs對腫瘤的重要意義，NOXs被認為是一個潛在的ROS調(diào)控和抑癌靶標。NOXs的小分子抑制劑在調(diào)控ROS上具有多方面的優(yōu)勢。相比ROS清除劑，NOXs的抑制劑能夠?qū)崿F(xiàn)抑制特定的ROS來源而不干擾其他涉及到ROS的生物學過程。此外，設計靶向特定NOXs亞型的小分子抑制劑也有利于實現(xiàn)特性條件下的ROS調(diào)控。然而，人源NOXs高質(zhì)量結構數(shù)據(jù)的缺失，以及能夠?qū)OXs抑制與ROS清除兩種機制較好地區(qū)分的測活方法的缺乏長期以來限制了這一領域的發(fā)展。來自意大利帕維亞大學的A. Mattevi和來自哈佛醫(yī)學院/丹娜法伯癌癥研究所的H. Arthanari于近期在Nature Chemical Biology上發(fā)表文章^[1]，報道了具有同工酶選擇性的人源NOXs小分子抑制劑的高通量虛擬篩選，并基于篩選得到的化合物進行了骨架優(yōu)化及活性測試。

——實驗方法——

文章所報道的抑制劑篩選流程如圖1所示。作者在早期工作中鑒定到來自一種微生物柱胞藻（C. stagnale）的NOX5，csNOX5，與人源NOX5具有40%的序列相似度，且兩者的活性位點亦是高度保守的。因此，作者認為csNOX5的結構可以外推到人源NOX抑制劑的虛擬篩選。通過對csNOX5的結構分析，作者發(fā)現(xiàn)csNOX5的FAD和NADPH結合位點之間的裂隙是一個潛在的可藥位點。因此作者使用開源的虛擬篩選平臺VirtualFlow^[2]分別針對csNOX5的脫氫酶結構域與FAD的共晶結構以及無FAD結合的晶體結構進行兩輪虛擬篩選。每一輪中均篩選3.5億個小分子化合物，其中3.4億個來自Enamine的REAL數(shù)據(jù)庫，其余的1000萬個來自于ZINC15化合物庫。對接結果按照對接打分進行排序，并過濾掉lopP過小或具有毒性官能團等的化合物。

對于虛擬篩選中挑選出的化合物，作者設計了多輪實驗驗證其生物學活性。首先在純化的csNOX5上驗證其抑制活性，對于10 μM下抑制率大于50%的化合物用熱遷移實驗進一步篩選，并挑選能使蛋白的Tm值升高2℃以上的化合物進行第二輪實驗。第二輪實驗中作者使用從NOXs高表達的細胞中提取出的膜系統(tǒng)組分進行人源NOXs的活性實驗。此外，作者設計了多項對照試驗以排除非預期功能的化合物，包括使用未轉(zhuǎn)染NOXs細胞的膜系統(tǒng)以及未激活的NOXs進行對照試驗以排除脫靶，采用PMS-NADH/NBT測試體系排除具有活性氧清除功能的化合物，在其他核黃素依賴的氧化酶上進行抑制實驗以排除廣譜抑制劑三項。對于從兩輪實驗中脫穎而出的苗頭化合物，作者在體外使用純化的人源NOXs進行了活性實驗，并通過NMR或者晶體學方法驗證其結合。進一步地，在細胞上測試化合物對細胞水平ROS的抑制情況，以及使用細胞熱轉(zhuǎn)移實驗（CESTA）驗證化合物在胞內(nèi)的靶向性。

圖1人NOX抑制劑篩選的實驗流程

——主要結果——

兩輪虛擬篩選以后，一共304個候選化合物進入第一輪實驗，其中有51個化合物進入第二輪實驗。最終，8個化合物通過了前兩輪實驗篩選進入后續(xù)的活性分析，羅列于圖2。這8個化合物在csNOX5上都表現(xiàn)出了非競爭抑制的特點，抑制常數(shù)K_i在亞微摩爾到數(shù)十微摩爾不等。作者使用微量熱涌動（MST）測定了化合物1和化合物3與csNOX5的親和力，其解離常數(shù)K_d亦在微摩爾級別。

圖2虛擬篩選和實驗初篩以后挑選的8個化合物的結構

值得注意的是，所有8個化合物都是在FAD存在下的對接中被挑選出的，并且當FAD存在時，化合物對csNOX5的穩(wěn)定化作用均變強，暗示FAD在化合物的結合和抑制機制中的重要角色?；衔锱ccsNOX5的共晶結構解析進一步證實了這一猜想。圖3列出了4個衍射較好的化合物與csNOX5的共晶結構，分別為化合物2（圖3d），3（圖3a），4（圖3b），6（圖3c）。所有化合物都正確地結合在了預期口袋內(nèi)，并且化合物中的環(huán)系都與FAD產(chǎn)生了一定的堆積，這也解釋了FAD在化合物結合中的貢獻。此外，C668、T541等殘基也參與到多個化合物的結合中。對于未能取得有較好衍射的晶體的化合物1，作者通過NMR滴定的方法確認了其與csNOX5的結合。進一步地，作者在含有人源NOX1/2/4/5的膜上對8個化合物進行酶活實驗，以評估其IC₅₀和K_i。通過比較化合物在不同NOXs亞型上的抑制效果，作者發(fā)現(xiàn)在8個化合物中，化合物3和化合物5可以作為人源NOX1/2/4的潛在選擇性抑制劑，而化合物1可以作為人源NOX5的潛在選擇性抑制劑（表1）。

圖3化合物與csNOX5的共晶結構分析

表1候選化合物對人源NOXs的IC50值（單位均為μM）

在分析候選化合物與csNOX5的共晶結構時，作者發(fā)現(xiàn)這些化合物都占據(jù)了原先csNOX5中C端一個與核黃素形成pi-pi堆積的苯丙氨酸的位置，暗示csNOX5的C端在結合抑制劑前后的構象發(fā)生了比較明顯的改變，如圖4。在先前的研究中，研究者們推測csNOX5的C端構象變化與蛋白和NADPH的結合能力密切相關，這一發(fā)現(xiàn)證實了這一推測，同時也指出苯丙氨酸偏移后的csNOX5構象可以用于抑制劑的虛擬篩選中?；谶@一構象，作者在第三輪的虛擬篩選中篩選了1.54億個化合物，并挑選出124個化合物進行了實驗驗證。

圖4候選小分子抑制劑與csNOX5結合前后csNOX5 C端殘基構象變化

經(jīng)過與前述方法相同的多輪實驗篩選后，作者挑選出了 4個化合物（如圖5），并測試了其對人源NOXs上的抑制能力。遺憾的是，這四個化合物均未能在人源NOXs上表現(xiàn)出較好的活性。

圖5針對csNOX5 C端變化構象對接篩選出的候選化合物結構

總結一下候選化合物的篩選階段，作者提出了兩種不同的虛擬篩選思路，并基于多種體外的活性實驗一共篩選出了12個可能的活性化合物，其中3個化合物具有發(fā)展成人源NOXs選擇性抑制劑的潛力。下面介紹作者針對候選化合物在酶活上表現(xiàn)最好的化合物3進行的簡單骨架優(yōu)化思路?；衔?/span>3可以分成四環(huán)的并環(huán)體系和[4,5]螺環(huán)兩個部分，中間由一根sp²C-N鍵相連，在酶動力學實驗上表現(xiàn)為非NADP競爭性抑制劑。作者先分析了csNOX5與化合物3和NADP+的共晶結構，以確認其抑制機制。當化合物3結合到csNOX5時，NADP+的煙酰胺與抑制劑和FAD形成三層的堆疊結構，因而NADP+和FAD之間的電子轉(zhuǎn)移被抑制劑阻斷（如圖6b）。此外，化合物3中[4,5]螺環(huán)的結構在csNOX5結合NADP+前后也相對垂直于堆疊結構的軸發(fā)生了約120°的旋轉(zhuǎn)，如圖6a，作者推測這是為了避免螺環(huán)與NADP+產(chǎn)生大的碰撞?？紤]到這種誘導適應性結合模式，作者推測提高螺環(huán)結構在分子中的轉(zhuǎn)動靈活性對于提高化合物活性是有利的，因此引入了二級胺作為連接基團，得到化合物14.在化合物14的基礎上作者針對[4,5]螺環(huán)部分的結構進行進一步的SAR，最終得到同時具有高抑制活性和良好NOX2選擇性的化合物15。 值得注意的是，從化合物14到化合物15，其選擇性發(fā)生了明顯的改變（化合物14對NOX2幾乎沒有抑制活性，而對NOX4/5活性較好）。

a. NADP+存在與否下化合物3與csNOX5的晶體結構對比，深藍色為無NADP+的結構，淺藍色為有NADP+的結構; b. 化合物3與csNOX5和NADP+的共晶結構; c. 化合物3的骨架改造; d. 骨架改造后化合物的活性結果

作者在細胞模型上進一步地測試了體外實驗中拿到的候選化合物。在實驗篩選時，作者已經(jīng)通過對照試驗排除了具有活性氧清除功能的化合物，因此可以直接通過使用相應激活劑刺激NOX2/4/5高表達的細胞株并檢測ROS含量來評價化合物的細胞活。在體外活性較好的化合物1，3以及改造后的化合物15對不同亞型NOXs的細胞活性列于表2。CESTA實驗驗證了這些化合物在細胞內(nèi)對相應NOXs的靶向性。對照體外生化實驗和細胞實驗結果，這些化合物對不同NOX亞型的選擇性表現(xiàn)是較為一致的。

表2 化合物在NOXs高表達細胞模型上的EC50值（單位均為μM）

最后，作者使用了由Todd Golub等人開發(fā)的PRISM方法^[3]系統(tǒng)地研究了候選化合物對癌細胞生長的抑制能力。PRISM方法的基本原理是使用慢病毒將24bp的條形碼序列穩(wěn)轉(zhuǎn)到不同的腫瘤細胞系中，并將不同的腫瘤細胞系等量均勻混合后凍存。將制備好的混合細胞系復蘇后加藥處理，并提取處理后活細胞中的基因組DNA?；蚪MDNA的條形碼序列被含有生物素的引物PCR擴增后，分別用含有相應互補序列的鏈霉親和素微珠捕獲，然后就可以對各種條形碼序列進行定量，其相對數(shù)量差異就可以反映不同細胞系對化合物的敏感程度。PRISM實驗指出多種血液瘤對化合物3最為敏感；相應地，這些腫瘤細胞中多存在NOX2高表達和激酶突變造成的ROS產(chǎn)生增加現(xiàn)象。這一結果也符合化合物3在體外和細胞實驗中對NOX2的靶向性。此外，NOX4高表達的膠質(zhì)母細胞瘤A1207，SNU1105和腎癌細胞系RCC10RGB亦對化合物3敏感；而對NOX5具有一定選擇性的化合物1對NOX5高表達的泌尿系統(tǒng)腫瘤表現(xiàn)出較好的抑制能力，對其他腫瘤則無明顯的抑制效果。這些結果說明開發(fā)選擇性抑制不同亞型NOX的抑制劑的重要性和潛在價值。由于Ras激酶家族促進細胞增殖需要ROS信號，作者還在同時具有NOX2高表達和KRasG12D突變的腫瘤細胞系上測試了化合物3與KRas抑制劑MRTX1133連用的效果，并發(fā)現(xiàn)化合物3一定程度上提高了腫瘤細胞對MRTX1133的敏感程度。這些結果進一步地說明了開發(fā)ROXs抑制劑的潛在臨床價值。

——小結——

作者從來源于微生物的NOX酶csNOX5的結構出發(fā)，通過高通量篩選和生化實驗鑒定到了對人源NOXs具有抑制作用的小分子化合物。盡管這些化合物在結合模式上表現(xiàn)出了一定的相似性，都依賴于化合物與FAD形成的pi-pi堆積，其對不同亞型NOX的選擇性有明顯的差別。這一選擇性進一步地被細胞實驗和表達不同亞型NOXs細胞的PRISM實驗所驗證。除此以外，作者還在實驗中發(fā)現(xiàn)了兩個有趣的結論。一是通過比較csNOX5 C端在化合物結合前后的構象變化，驗證了NOXs的C端構象具有調(diào)控NADP+結合能力和蛋白酶活的功能。遺憾的是，針對相應的非活性構象的虛擬篩選沒有得到有潛力的化合物分子。二是將選擇性NOXs抑制劑與KRasG12D抑制劑聯(lián)用，提高了G12D抑制劑的抑制效果，暗示ROXs抑制劑在臨床上的應用方向。由于人源NOXs的高分辨實驗結構的缺乏（作者在文章中也提到了這一點），目前還不能討論使用csNOX5進行虛擬篩選在多大程度上會影響結果。此外，從活性的角度來討論，文章中對于化合物的SAR還尚不完善，對于為什么分子中螺環(huán)基團改變會影響選擇性也沒有機制層面的探討。而SAR分析，尤其是對于不同同工酶的選擇性進行構效關系探索，也需要高置信度的口袋結構。這也是文章研究主要的局限性之一。

參考文獻

[1] Reis, J., Gorgulla, C., Massari, M., andet al. Targeting ROS production through inhibition of NADPH oxidases. Nat. Chem. Biol, 2023, 19, 1540-1550. doi: 10.1038/s41589-023-01457-5

[2] Gorgulla, C., Boeszoermenyi, A., Wang, Z., andet al. An open-source drug discovery platform enables ultra-large virtual screens. Nature 2020, 580, 663–668. doi:10.1038/s41586-020-2117-z

[3] Yu, C., Mannan, A. M., Yvone, G. M., and et al. High-throughput identification of genotype-specific cancer vulnerabilities in mixtures of barcoded tumor cell lines. Nat. Biotechnol. 2016, 34, 419-423. doi: 10.1038/nbt.3460