scATAC-seq已成為剖析調(diào)控環(huán)境和細(xì)胞異質(zhì)性的強(qiáng)大工具。近日，《Nature Biotechnology 》發(fā)表了一項(xiàng)scATAC-seq方法的基準(zhǔn)測(cè)試，研究人員使用人類外周血單核細(xì)胞（PBMC）作為參考樣本，對(duì)8種scATAC-seq方法的性能進(jìn)行了基準(zhǔn)測(cè)試，并開(kāi)發(fā)了PUMATAC（一種通用的預(yù)處理流程），用于處理各種測(cè)序數(shù)據(jù)格式。

研究團(tuán)隊(duì)對(duì)8種不同的scATAC-seq方法進(jìn)行了系統(tǒng)的多中心基準(zhǔn)研究，包括10x Genomics scATAC-seq (v1, v1.1, v2，multiome，mtscATAC）、Bio-Rad ddSEQ、HyDrop和s3-ATAC。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖

scATAC-seq測(cè)序?qū)嶒?yàn)通常效率很低，應(yīng)執(zhí)行方案優(yōu)化步驟，以最大限度地提高細(xì)胞質(zhì)量和文庫(kù)復(fù)雜性，并最大限度地減少環(huán)境染色質(zhì)污染和PCR重復(fù)。雖然s3-ATAC和HyDrop的測(cè)序效率均明顯低于商業(yè)檢測(cè)，但這種靈敏度降低是由不同的機(jī)制引起的；s3-ATAC樣品包含許多峰區(qū)域之外的片段，而HyDrop片段高度重復(fù)。

在靈敏度方面，10x v2表現(xiàn)最佳，平均每個(gè)細(xì)胞峰中回收10,021個(gè)獨(dú)特片段，顯著高于 Bio-Rad ddSEQ (4,228)、HyDrop (1,180) 和s3-ATAC (1,203) 。TSS富集在不同方法中也存在顯著分層，10x v1.1、mtscATAC 和s3-ATAC得分≤ 21.7，10x v1、v2、multiome和HyDrop樣本得分在25.2至27.6 之間，Bio-Rad ddSEQ得分平均為32.6。HyDrop (38.5%)、mtscATAC-seq (37.3%) 和s3-ATAC (18.9%) 中的FRIP顯著低于Bio-Rad ddSEQ 和其他10x方法(57.3–62.7%)。

隨著測(cè)序深度的增加，獨(dú)特片段的數(shù)量有所增加，但在各種技術(shù)的不同水平上都達(dá)到飽和。例如，在較低的測(cè)序深度下，ddSEQ樣本的表現(xiàn)優(yōu)于10x v1、v1.1和multiome，但在較高的測(cè)序深度下效果卻相反。TSS富集也取決于測(cè)序深度，但很快飽和。由于duplicate reads的增加，測(cè)序效率隨著測(cè)序深度的增加而降低。

研究團(tuán)隊(duì)使用Scrublet和Freemuxlet的模擬數(shù)據(jù)或基因型信息識(shí)別了雙胞。Scrublet的雙峰分?jǐn)?shù)隨著峰中獨(dú)特片段的中位數(shù)線性下降，而Freemuxlet的置信度隨著這些指標(biāo)的增加而增加，這表明片段的數(shù)量是雙峰檢測(cè)背后的關(guān)鍵因素。

與Scrublet和Freemuxlet類似，Seurat的置信度強(qiáng)烈依賴于測(cè)序深度和每個(gè)細(xì)胞的獨(dú)特片段數(shù)量。10x和Bio-Rad ddSEQ方法都獲得了較高的中位標(biāo)簽轉(zhuǎn)移分?jǐn)?shù)，而HyDrop和 s3-ATAC 的分?jǐn)?shù)明顯較低。

在本研究的細(xì)胞計(jì)數(shù)平衡分析中，10x方法在所有細(xì)胞類型中比ddSEQ和HyDrop回收了更多的DAR。s3-ATAC也回收了大量DAR，但與其他技術(shù)相比,強(qiáng)度大大降低。就DAR強(qiáng)度而言，10x v1和v2表現(xiàn)最好，ddSEQ的表現(xiàn)與其余10x方法相當(dāng)。

此外，研究團(tuán)隊(duì)在上述細(xì)胞類型平衡子集的合并數(shù)據(jù)集上計(jì)算了細(xì)胞類型特異性DAR。對(duì)最強(qiáng)DAR處的scATAC-seq信號(hào)或每種細(xì)胞類型前2,000個(gè)最強(qiáng)DAR的比較顯示10x方法和Bio-Rad ddSEQ之間的信號(hào)總體一致。s3-ATAC和HyDrop在DAR周圍都顯示出較弱的信號(hào)。

在所有細(xì)胞類型中，來(lái)自10x方法的DAR在轉(zhuǎn)錄因子基序的歸一化富集分?jǐn)?shù)中得分最高。ddSEQ、s3-ATAC和HyDrop得分明顯較低。

為了比較每種方法檢測(cè)樣本之間差異的能力，研究團(tuán)隊(duì)重點(diǎn)關(guān)注男性和女性樣本之間觀察到的差異。與細(xì)胞類型特異性DAR獲得的結(jié)果類似，ddSEQ捕獲的DAR比10x方法更少且更弱，但差異不太明顯。s3-ATAC和 HyDrop都恢復(fù)了更少、更弱或沒(méi)有性別特異性DAR。

除了使用PBMC進(jìn)行系統(tǒng)基準(zhǔn)測(cè)試之外，研究團(tuán)隊(duì)還使用了公開(kāi)的成年小鼠皮層scATAC-seq數(shù)據(jù)。在所有指標(biāo)中，10x和ddSEQ的表現(xiàn)明顯優(yōu)于HyDrop和s3-ATAC。

研究團(tuán)隊(duì)參考樣本資源和統(tǒng)一的數(shù)據(jù)處理流程系統(tǒng)地比較不同的scATAC-seq方法。這些方法在細(xì)胞類型識(shí)別和轉(zhuǎn)錄因子活性方面基本一致，但在測(cè)序庫(kù)質(zhì)量和開(kāi)放染色質(zhì)位點(diǎn)的標(biāo)記特異性方面存在明顯差異。一般來(lái)說(shuō)，HyDrop和s3-ATAC在大多數(shù)質(zhì)量控制指標(biāo)中的表現(xiàn)明顯較低。HyDrop捕獲的片段明顯少于10x和Bio-Rad方法。s3-ATAC 片段不太可能在TSS周圍富集，并且在 HyDrop中觀察到高重復(fù)率，這表明這些非商業(yè)技術(shù)在PBMC樣品中有優(yōu)化的空間。

scATAC-seq實(shí)驗(yàn)的測(cè)序效率普遍較低。有兩種策略可以緩解這個(gè)問(wèn)題：優(yōu)化樣品制備和核提取方案，以盡量減少樣品中環(huán)境染色質(zhì)的數(shù)量，潛在地應(yīng)用FACS進(jìn)行樣品清理，以及在文庫(kù)飽和以下測(cè)序，以限制duplicate reads的數(shù)量。

除了評(píng)估不同的 scATAC-seq 方法之外，此項(xiàng)研究還為單細(xì)胞基因組學(xué)研究提供了分析工具——PUMATAC，流程可公開(kāi)用作商業(yè)軟件的開(kāi)源替代品，并且可以靈活地分析當(dāng)前和未來(lái)的數(shù)據(jù)類型。

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